發(fā)布時(shí)間：2020-07-23 16:27

【摘要】：背景:巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)重要組成部分,它在鐵代謝的調(diào)節(jié)中也起非常重要的作用。巨噬細(xì)胞通過最大限度的攝取、儲(chǔ)存鐵,并減少鐵的排出,減少病原體所能利用的鐵離子,從而限制其生長、增殖;同時(shí),巨噬細(xì)胞利用胞質(zhì)內(nèi)的游離鐵,通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì),以殺滅被吞噬的病原體。另一方面,巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵過載,也會(huì)改變巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài),但是鐵過載是如何促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)改變還缺乏相關(guān)研究。本研究旨在探討鐵過載通過何種途徑對巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)產(chǎn)生影響,并運(yùn)用這種效應(yīng),提出可能的相關(guān)疾病治療方式。方法:使用DCFH-DA探針檢測經(jīng)鐵劑處理后的巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平;采用WB、qRT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記物(IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-10、CD206和CD86)表達(dá)水平;通過Western blot、qRT-PCR檢測經(jīng)鐵劑處理后巨噬細(xì)胞p53及乙�；痯53表達(dá)水平;然后通過Western blot、qRT-PCR檢測GSH和C646預(yù)處理對巨噬細(xì)胞p53表達(dá)及乙�；�、極化指標(biāo)(TNF-α、CD206、Arg-1和iNOS)的影響;最后通過建立裸鼠皮下瘤模型(H22肝癌細(xì)胞:RAW264.7細(xì)胞=4:1,皮下注射)驗(yàn)證機(jī)體內(nèi)鐵過載對腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響。結(jié)果:熒光顯微鏡觀察的DCFH-DA探針顯示,與對照組相比,經(jīng)鐵劑處理2小時(shí)后的巨噬細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS,而同時(shí)使用GSH+鐵劑處理的巨噬細(xì)胞內(nèi)并未見到大量ROS產(chǎn)生。同時(shí),使用Western Blot、qRT-PCR和FCM檢測,發(fā)現(xiàn)對照組和GSH+鐵劑處理組相比,僅使用鐵劑處理的巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β、TNF-α、iNOS、CD86表達(dá)明顯升高(P0.01),TGF-β、IL-10、CD206表達(dá)無明顯差異(P0.05);另外,Western Blot和q RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅使用鐵劑處理組巨噬細(xì)胞內(nèi)p53表達(dá)較對照組和GSH+鐵劑處理組明顯升高(P0.05)。隨后,我們使用相同濃度鐵劑,對巨噬細(xì)胞處理不同時(shí)間(0-8小時(shí)),經(jīng)Western Blot、qRT-PCR檢測證實(shí)p53表達(dá)隨處理時(shí)間增加而升高(P0.05)。隨后,我們檢測了p53乙�；�,經(jīng)Western Blot證實(shí),p53乙�；揭搽S鐵劑處理時(shí)間增加而升高。然后,我們使用C646抑制p53的乙�；�,并通過Western Blot檢測p53乙�；种菩�(yīng),證實(shí)C646+鐵劑處理組能夠明顯抑制p53的乙�；�(P0.01,與鐵劑處理組相比),同時(shí),還發(fā)現(xiàn)GSH+鐵劑處理組巨噬細(xì)胞p53乙�；裁黠@低于鐵劑處理組(p0.01),但是高于對照組(P0.05)。Western Blot、qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)C646+鐵劑處理組IL-1β、TNF-α、iNOS表達(dá)較鐵劑處理組低(P0.01),與對照組無明顯差異(P0.05)。最后,我們使用H22鼠源性肝癌細(xì)胞系及RAW264.7鼠源性巨噬細(xì)胞系按4比1的比例行裸鼠皮下成瘤,10只裸鼠均在成瘤前接受尾靜脈檸檬酸鐵溶液注射(鐵劑組)或生理鹽水注射(對照組)。皮下細(xì)胞系注射后第3天開始測量腫瘤體積,于第21天完整取下腫瘤(每組均成瘤4只),稱量腫瘤質(zhì)量。經(jīng)統(tǒng)計(jì)計(jì)算后,發(fā)現(xiàn)鐵劑組小鼠皮下瘤與對照組相比生長相對緩慢,完整皮下腫瘤質(zhì)量小于對照組(P0.01)。皮下瘤冰凍切片,使用免疫組織熒光染色,發(fā)現(xiàn)鐵劑組與對照組皮下瘤組織內(nèi)F4/80表達(dá)無明顯差異,但鐵劑組CD86表達(dá)明顯增加。同時(shí),我們使用超氧化物陰離子熒光探針檢測腫瘤組織內(nèi)活性氧產(chǎn)生水平,發(fā)現(xiàn)鐵劑組皮下瘤組織內(nèi)有更多的ROS產(chǎn)生。結(jié)論:巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵過載能促進(jìn)ROS生成,該現(xiàn)象可能通過芬頓反應(yīng)實(shí)現(xiàn),即Fe~(2+)+H_2O_2→Fe~(3+)+OH~-+OH·。在ROS大量產(chǎn)生的同時(shí),巨噬細(xì)胞向M1型極化;使用GSH減少巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS的含量,巨噬細(xì)胞M1型極化也減弱,提示鐵過載通過促進(jìn)ROS的產(chǎn)生,誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞M1型極化。在隨后的實(shí)驗(yàn)中,使用Western blot,qRT-PCR檢測顯示p53表達(dá)及乙酰化都隨鐵劑處理時(shí)間延長而增加,而通過GSH抑制ROS后,鐵劑處理促進(jìn)p53表達(dá)和乙�；黾拥男�(yīng)減弱;使用C646抑制p53的乙�；�,鐵劑促巨噬細(xì)胞M1型極化也減弱。這些結(jié)果說明,乙�；痯53也參與了鐵過載促巨噬細(xì)胞的M1型極化。所有的研究結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵過載可能通過促進(jìn)ROS產(chǎn)生,增加p53乙�；D(zhuǎn)移酶活性,誘導(dǎo)p53表達(dá)及乙�；�,最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M1型極化。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

圖 2 ROS 誘導(dǎo) p53 蛋白表達(dá)A：Western blot 檢測鐵劑刺激后不同時(shí)間巨噬細(xì)胞內(nèi) p53 蛋白的表達(dá)；B：qRT-PCR 檢測鐵劑刺激不同時(shí)間后巨噬細(xì)胞內(nèi) p53 RNA 的表達(dá) a:P＜0.01 與 0 h 比較；b：P＜0.01，與 2h比較；c：P＜0.01，與 4h 比較；C：Western blot 檢測巨噬細(xì)胞內(nèi) p53 蛋白的表達(dá)；D：qRT-PCR檢測巨噬細(xì)胞內(nèi) p53 RNA 的表達(dá)；a：P＜0.01，與 Control 組比較；b：P＜0.01，與 Iron +GSH 組比較。Figure 3. ROS production induced p53 expression.(A, B) Western-blotting and qRT-PCR showed that iron induced the expression of p53and p21 in a time-dependent manner (P＜0.01),a:P＜0.01 vs 0h, b:P＜0.01 vs 2h, c:P＜ 0.01 vs 4h. (C) Western-blotting and qRT-PCR showed that NAC repressed p53expression (P＜0.01), a:P＜0.01vs control,b:P＜0.01vs Iron+GSH.3.3 ROS 誘導(dǎo) p53 乙�；�，抑制 p53 乙�；孓D(zhuǎn)鐵離子的促 M1 型

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文發(fā)現(xiàn)，p300/CBP 抑制劑能夠明顯抑制 p53 的乙�；�，但并不影響 p53 的表達(dá)，而GSH 則同時(shí)抑制 p53 表達(dá)和乙�；�(圖 3C、D)。隨后，再通過 Western blot、qRT-PCR 檢測巨噬細(xì)胞極化的標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn) p300/CBP 抑制劑和 GSH 都能夠抑制鐵劑刺激引起的 M1 型極化(圖 3E、F)。這些結(jié)果說明 ROS 可能通過乙�；� p53來調(diào)控鐵劑誘導(dǎo)的 M1 型極化。

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本文編號(hào)：2767560