發(fā)布時(shí)間：2020-07-23 18:58

【摘要】：在真核細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是鈣離子儲(chǔ)存、蛋白質(zhì)合成、折疊、加工及質(zhì)量監(jiān)控的重要場(chǎng)所,當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生異常變化或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)難以承擔(dān)蛋白折疊的高負(fù)荷時(shí)則引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress),激活細(xì)胞的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR),細(xì)胞通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白ATF6、PERK和IRE1介導(dǎo)的三條關(guān)鍵的UPR信號(hào)通路,調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá),以增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜對(duì)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)及對(duì)蛋白折疊的處理能力,因此UPR通路在細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)平衡中具有舉足輕重的作用。而這一動(dòng)態(tài)過(guò)程的調(diào)控對(duì)于維持機(jī)體的正常生理功能至關(guān)重要,在肝臟、脂肪、胰島以及下丘腦等不同的組織器官中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均影響代謝活動(dòng)。 眾所周知,隨著人們生活水平的提高,糖尿病(尤其是2型糖尿病)的發(fā)病率呈快速升高的趨勢(shì)。2型糖尿病病理發(fā)展的最終結(jié)果是胰島β細(xì)胞的凋亡,目前人們普遍接受的機(jī)制是持續(xù)高糖、游離脂肪酸(FFA)可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,ER stress如不能被有效緩解或消除則可啟動(dòng)β細(xì)胞的凋亡程序。 核受體是一類(lèi)依賴(lài)配體激活的轉(zhuǎn)錄因子超家族,它具有三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：N末端的激活結(jié)構(gòu)域(AF-1)、中間的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和C末端的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)。根據(jù)核受體DBD序列的同源性發(fā)現(xiàn)了大量的孤核受體,它們的生理性配體及其功能最初并不清楚。NR4A家族即是這類(lèi)孤核受體,目前尚未找到其天然的配體。 NR4A1(又稱(chēng)為NUR77、TR3、NGFI-B)、NR4A2(又稱(chēng)為NURR1、RNR-1、TONOR)、NR4A3(又稱(chēng)為NOR1、MINOR)三者組成孤核受體NR4A家族。NR4A家族的三個(gè)成員在DBD區(qū)約91-95%的序列高度同源,LBD區(qū)約60%序列保守,而激活結(jié)構(gòu)域序列變化較大。NR4A家族是一類(lèi)早期即刻反應(yīng)基因,細(xì)胞在感受到環(huán)境的生理與物理刺激時(shí),這個(gè)家族的基因就會(huì)迅速反應(yīng),產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白,作為轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)一定的基因表達(dá)從而來(lái)應(yīng)對(duì)這些刺激。目前關(guān)于NR4A家族與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系研究很少,而且NR4A家族分子與容易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的胰島p細(xì)胞,特別是p細(xì)胞中胰島素的分泌及表達(dá)的關(guān)系也有待去探索。 本課題的工作分以下兩部分展開(kāi)： 第一部分在胰島p細(xì)胞和肝細(xì)胞中孤核受體NR4A家族的表達(dá)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系 研究目的：探討在胰島p細(xì)胞和肝細(xì)胞中,細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)孤核受體NR4A家族分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化及二者之間的關(guān)系。 研究?jī)?nèi)容 1、用不同濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG(毒胡蘿卜素)、TM(衣霉素)、PA(棕櫚酸鈉鹽)、DTT(二硫蘇糖醇)刺激小鼠胰島p細(xì)胞MIN6,熒光定量PCR分析UPR標(biāo)志分子Bip、Chop及NR4A家族三個(gè)成員(Nr4al、Nr4a2、Nr4a3) mRNA表達(dá)變化；逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)分析UPR標(biāo)志分子剪接型Xbpl (sXbp1)的表達(dá)變化,篩選出既能激活細(xì)胞UPR又能誘導(dǎo)NR4A家族表達(dá)的合適加藥劑量。 2、對(duì)培養(yǎng)的小鼠胰島p細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠肝癌細(xì)胞Hepal-6、小鼠脂肪前體細(xì)胞3T3-L1完全置換新鮮培養(yǎng)基,熒光定量PCR分析換液后0h,1h,2h,3h,4h,6h,9h,12h NR4A家族分子mRNA表達(dá)變化, western blotting分析NR4A1蛋白表達(dá)變化,為后續(xù)加藥方式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 3、用0.5μM TG分別處理小鼠胰島p細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝癌細(xì)胞Hepal-6,在加藥后Oh、15min、30min、1h、2h、3h、6h、9h、12h分別收集細(xì)胞提取RNA和蛋白質(zhì),用RT-PCR、熒光定量PCR和western blotting技術(shù)分析細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及NR4A家族分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。 4、用10μg/ml TM分別處理小鼠胰島β細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝癌細(xì)胞Hepal-6,在加藥后0h、15min、30min、1h、2h、3h、6h、9h、12h分別收集細(xì)胞提取RNA和蛋白質(zhì),用RT-PCR、熒光定量PCR和western blotting技術(shù)分析細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及NR4A家族分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。 5、用0.5mM PA分別處理小鼠胰島p細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6,在加藥后6h.8h、10h、12h、16h、20h、24h分別收集細(xì)胞提取RNA和蛋白質(zhì),用RT-PCR、熒光定量PCR和western blotting技術(shù)分析細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及NR4A家族分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。 6、用3mM DTT分別處理小鼠胰島β細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6,在加藥后Oh、30min、1h、2h、3h、4h、6h、9h分別收集細(xì)胞提取RNA,用RT-PCR和熒光定量PCR技術(shù)分析細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及NR4A家族分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。 7、選用C57BL/6-ob/ob雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)材料,同周齡的C57BL/6小鼠為對(duì)照組,以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),每周稱(chēng)量動(dòng)物體重一次,建立小鼠肥胖癥動(dòng)物模型。造模成功后,處死動(dòng)物,取胰腺、肝臟組織進(jìn)行RNA提取,熒光定量PCR分析肥胖體征動(dòng)物中UPR標(biāo)志分子及NR4A家族分子的表達(dá)變化。 8、用0.5μM TG刺激MIN6細(xì)胞Oh、3h、6h,通過(guò)細(xì)胞核質(zhì)分離試劑盒抽提核蛋白和胞漿蛋白,以western blotting技術(shù)分析NR4A1在細(xì)胞中的表達(dá)及分布情況。 9、用0.5μMTG刺激HepG2細(xì)胞2h,0.5mMPA刺激HepG2細(xì)胞10h,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)NR4A1的表達(dá)及分布情況。 研究結(jié)果 1、MIN6細(xì)胞中,0.1-1μM TG處理2h、10μg/ml TM處理3h、2-4mM DTT刺激2h、0.4-0.8mM PA刺激12h能極顯著的誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)(P0.01),導(dǎo)致NR4A家族分子mRNA表達(dá)顯著增加(P0.01),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)篩選出各誘導(dǎo)劑的合適劑量,即0.5μM TG、10μg/ml TM、3mM DTT、0.5mM PA。 2、MIN6、HepG2、Hepa1-6、3T3-L1四種細(xì)胞在完全置換培養(yǎng)基后4h內(nèi),NR4A家族三個(gè)分子1mRNA水平均明顯升高；MIN6細(xì)胞中NR4A1蛋白水平在換液后1-6h顯著高于基礎(chǔ)水平,2h達(dá)到峰值；換液6h后NR4A家族三個(gè)分子mRNA和蛋白水平逐漸下降恢復(fù)到基礎(chǔ)水平,這說(shuō)明換液短時(shí)間內(nèi)NR4A家族處于高表達(dá)水平,因此需要改變后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的加藥方式,即在加藥處理前12h給細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)基,加藥時(shí)吸取一定體積的誘導(dǎo)劑貯存液(1mM TG、5mg/ml TM、1M DTT)直接加入培養(yǎng)基中；而0.5mM PA仍采取完全置換含藥培養(yǎng)基的處理方式。 3、用0.5μM TG處理小鼠胰島β細(xì)胞MIN6、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6三種細(xì)胞,均能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)(UPR),同時(shí)誘導(dǎo)孤核受體NR4A家族所有分子的表達(dá),其中以NR4A1和NR4A2表達(dá)升高程度更為顯著。 4、用10μg/ml TM處理MIN6、HepG2、Hepal-6三種細(xì)胞,同TG處理一樣,均能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)(UPR), NR4A分子被誘導(dǎo)表達(dá),但NR4A家族mRNA在TM處理后的表達(dá)增加幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于TG處理,最高增加倍數(shù)僅為T(mén)G處理增加倍數(shù)的40%,且TM處理時(shí)以NR4A2分子應(yīng)答為主。 5、用0.5mM PA處理MIN6、HepG2、Hepal-6三種細(xì)胞,雖然能激活UPR相關(guān)信號(hào)通路的分子表達(dá),但各基因表達(dá)增加幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于TG處理；同時(shí)PA誘導(dǎo)表達(dá)的NR4A家族mRNA增加幅度也相應(yīng)的低于TG處理。在不同的細(xì)胞中對(duì)PA處理發(fā)生應(yīng)答的NR4A成員也不同。 6、用3mM DTT處理MIN6細(xì)胞、HepG2細(xì)胞引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NR4A家族誘導(dǎo)表達(dá)升高的方式和程度同0.5μM TG處理這兩種細(xì)胞相似。但3mM DTT對(duì)小鼠Hepal-6細(xì)胞的刺激結(jié)果同10μg/ml TM、0.5mM PA處理Hepal-6細(xì)胞類(lèi)似。 7、10周齡ob/ob小鼠體重是對(duì)照小鼠體重的1.7倍,ob/ob小鼠呈明顯的肥胖癥體征,熒光定量PCR分析表明肥胖小鼠胰腺和肝臟中UPR分子Bip、Chop表達(dá)明顯升高,孤核受體NR4A家族成員的mRNA水平也顯著高于對(duì)照小鼠。 8、用0.5μM TG處理MIN6細(xì)胞3h、6h,用western blotting法分析細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白中NR4A1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)TG處理誘導(dǎo)表達(dá)升高的NR4A1蛋白主要集中分布于細(xì)胞核中；用0.5μM TG處理HepG2細(xì)胞2h、0.5mM PA處理HepG2細(xì)胞10h,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,熒光顯微鏡觀察結(jié)果表示TG或PA誘導(dǎo)表達(dá)升高的NR4A1蛋白主要集中分布于細(xì)胞核內(nèi)。 研究結(jié)論 本部分實(shí)驗(yàn)可得出以下結(jié)論： 1、由于NR4A家族是早期即刻反應(yīng)基因,完全置換培養(yǎng)基就能誘導(dǎo)其表達(dá),因此時(shí)間動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意加藥方式,即細(xì)胞換液12h后,吸取一定體積的TG、TM、DTT誘導(dǎo)劑貯存液直接加入培養(yǎng)基中；而PA需要長(zhǎng)時(shí)間刺激才能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,因此仍采取完全置換含藥培養(yǎng)基的方式加藥處理。 2、用0.5μM TG、10μg/ml TM、0.5mM PA、3mM DTT,四種ER stress誘導(dǎo)劑處理胰島β細(xì)胞和肝細(xì)胞,在一定時(shí)間內(nèi)均能激活細(xì)胞的未折疊蛋白反應(yīng),同時(shí)細(xì)胞中孤核受體NR4A家族表達(dá)升高,雖然不同試劑的處理引起NR4A家族表達(dá)升高的幅度不同,但均說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)也引起NR4A家族的表達(dá)升高。 3、在肥胖動(dòng)物特別是基因缺陷造成的ob/ob肥胖癥小鼠中,肝臟、胰腺等組織中有明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生,同時(shí)NR4A家族分子的表達(dá)水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激呈一定的正相關(guān)。 4、在細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),表達(dá)升高的NR4A分子集中分布于細(xì)胞核中,這可能與NR4A分子作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)有關(guān)。 第二部分孤核受體NR4A家族對(duì)胰島p細(xì)胞中胰島素基因表達(dá)的調(diào)控 研究目的：探討孤核受體NR4A家族在胰島β細(xì)胞中對(duì)胰島素基因表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制。 研究?jī)?nèi)容 1、通過(guò)AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建包裝純化過(guò)表達(dá)NR4A1、NR4A3分子的兩種重組腺病毒(Ad-NR4A1-HA、Ad-NR4A3),選擇只表達(dá)GFP的載體腺病毒為對(duì)照病毒(Ad-GFP),通過(guò)紫外分光光度法和梯度稀釋感染法檢測(cè)病毒效價(jià)。 2、用0.5μM TG、0.5mM PA刺激小鼠胰島p細(xì)胞MIN6,以及用重組腺病毒感染MIN6細(xì)胞后,通過(guò)碘([125]I)放射免疫法測(cè)定葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)。 3、把Ad-NR4A1-HA, Ad-NR4A3兩種重組腺病毒分別梯度稀釋,用對(duì)照病毒Ad-GFP按相當(dāng)效價(jià)劑量補(bǔ)充以保證每組病毒顆粒數(shù)一致,感染兩種胰島p細(xì)胞(MIN6、 INS1),44h后通過(guò)放射免疫法測(cè)定葡萄糖刺激的胰島素分泌水平；用同樣方法稀釋的腺病毒Ad-NR4A3感染MIN6細(xì)胞48h后,收集細(xì)胞提取RNA, RT-PCR分析腺病毒感染后胰島素基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。 4、相當(dāng)效價(jià)的三種腺病毒(0.5μl/ml Ad-NR4A1-HA、0.5μl/ml Ad-NR4A3、0.25μl/ml Ad-GFP)感染接種于飛片上的MIN6細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色分析過(guò)表達(dá)NR4A1、 NR4A3蛋白在MIN6細(xì)胞中的定位分布情況。 5、用過(guò)表達(dá)NR4A1的慢病毒感染MIN6細(xì)胞,通過(guò)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)NR4A1的細(xì)胞株,收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白分離抽提,western blotting檢測(cè)NR4A1在MIN6細(xì)胞中的定位分布情況。 6、通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建hNR4A3cDNA野生型及各結(jié)構(gòu)域缺失突變體過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒(全長(zhǎng)野生型、ΔAF112-288aa, ΔDBD292-364aa,ΔLBD398-626aa), lipofectamine2000轉(zhuǎn)染各種質(zhì)粒進(jìn)入MIN6細(xì)胞中,通過(guò)稻瘟菌素篩選穩(wěn)定表達(dá)各種突變體的MIN6細(xì)胞株,western blotting檢測(cè)各蛋白過(guò)表達(dá)水平,RT-PCR分析各種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中胰島素基因Ins1、Ins2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。 7、相當(dāng)效價(jià)的三種腺病毒(0.5μl/ml Ad-NR4A1-HA、0.5μl/ml Ad-NR4A3、0.25μl/ml Ad-GFP)感染兩種胰島p細(xì)胞(MIN6、INS1), RT-PCR和熒光定量PCR分析胰島素基因及調(diào)控胰島素表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(NeuroDl、Pdxl、MafA、Glis3) mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。 研究結(jié)果： 1、成功構(gòu)建包裝純化了三種腺病毒,效價(jià)相當(dāng)?shù)娜N病毒的使用劑量為0.5μl/ml Ad-NR4A1-HA、0.5μl/ml Ad-NR4A3.0.25μl/ml Ad-GFP,感染MIN6細(xì)胞后均能達(dá)到80%以上的感染率。 2、用0.5μM TG、0.5mM PA處理MIN6細(xì)胞顯著降低了細(xì)胞分泌胰島素的能力；用Ad-NR4A1-HA、Ad-NR4A3腺病毒感染MIN6細(xì)胞也顯著減少了細(xì)胞分泌到上清中的胰島素含量(p0.01),初步說(shuō)明NR4A1/3過(guò)表達(dá)抑制了MIN6細(xì)胞的胰島素分泌功能。 3、梯度稀釋后的腺病毒感染兩種胰島p細(xì)胞,GSIS結(jié)果表明隨著NR4A1/3蛋白的表達(dá)增加,細(xì)胞分泌的胰島素下降,即NR4A1/3的表達(dá)量與細(xì)胞分泌的胰島素呈負(fù)相關(guān)；RT-PCR結(jié)果同樣說(shuō)明胰島素基因mRNA表達(dá)水平與NR4A3蛋白水平呈負(fù)相關(guān),即NR4A3蛋白表達(dá)越多,Insl和Ins2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)越少,說(shuō)明孤核受體NR4A家族分子具有下調(diào)胰島p細(xì)胞中胰島素基因表達(dá)的功能。 4、不管在重組NR4A1/3腺病毒感染的MIN6細(xì)胞中,還是篩選出的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NR4A1的MIN6細(xì)胞株中,過(guò)表達(dá)的NR4A分子均集中分布在細(xì)胞核中。 5、篩選得到NR4A3野生型和各結(jié)構(gòu)域缺失突變體的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)MIN6細(xì)胞株；野生型(N)和LBD缺失突變型(AL)細(xì)胞株中胰島素基因(Ins1、Ins2)的轉(zhuǎn)錄明顯低于對(duì)照細(xì)胞；而AF1區(qū)缺失型(AA)和DBD區(qū)缺失型(△D)細(xì)胞株中胰島素基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞無(wú)明顯的區(qū)別,說(shuō)明NR4A3分子中的AF1區(qū)和DBD區(qū)對(duì)下調(diào)胰島素基因轉(zhuǎn)錄是必需的。 6、兩種重組腺病毒(Ad-NR4A1-HA、Ad-NR4A3)感染兩種胰島p細(xì)胞(MIN6、INS1),熒光定量PCR分析說(shuō)明NR4A腺病毒感染的細(xì)胞中胰島素基因、胰島素調(diào)控因子基因mRNA水平均顯著低于對(duì)照病毒感染的細(xì)胞,說(shuō)明NR4A家族可以通過(guò)抑制胰島素相關(guān)調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄間接的下調(diào)胰島素基因的表達(dá)。 研究結(jié)論： 1、成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)NR4A家族分子的重組腺病毒及各種穩(wěn)轉(zhuǎn)MIN6細(xì)胞株。 2、在MIN6細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的NR4A家族蛋白集中分布在細(xì)胞核中,起轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用。 3、在胰島β細(xì)胞中,NR4A家族通過(guò)抑制胰島素轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)間接下調(diào)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄,抑制胰島素蛋白的分泌,從某種程度上可能緩解了胰島p細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的壓力,起到保護(hù)細(xì)胞的作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R329.26

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 毛婷;楊柳;劉勇;;細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與糖脂代謝紊亂的機(jī)制關(guān)聯(lián)[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年07期

本文編號(hào)：2767713