【摘要】：第一部分 帶有穿膜肽重組PTD-Oct4-6His的制備及活性鑒定 目的基因重組構(gòu)建具有穿膜活性轉(zhuǎn)錄因子PTD-Oct4-6His蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)。方法利用重疊延伸PCR法重組目的基因構(gòu)建質(zhì)粒PKYB-PTD-Oct4,并轉(zhuǎn)化至Ecoil ER2566。鎳柱層析純化重組蛋白并用Western bloting鑒定。用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記PTD-Oct4檢測(cè)其穿透中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)細(xì)胞細(xì)胞膜的能力；用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)檢測(cè)重組融合蛋白PTD-Oct4結(jié)合目的DNA的活性。結(jié)果成功獲得目的蛋白PTD-Oct4,其可以成功進(jìn)入細(xì)胞、定位細(xì)胞核內(nèi),穿膜效率為28.3±2.4%,并具有與目標(biāo)DNA序列特異結(jié)合的能力。結(jié)論本研究為制備重組PTD-Oct4并將其作為外源蛋白誘導(dǎo)靶細(xì)胞為多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, IPSCs)奠定基礎(chǔ)。 第二部分 小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 目的改良小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)方法,為角膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)、利用小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為IPS細(xì)胞、角膜組織工程等研究提供更好的種子細(xì)胞。方法采用Dispase酶消化法+組織塊法分離培養(yǎng)原代小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,通過(guò)間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色Vimentin表型和RT-PCR檢測(cè)Vimentin、Lumican和CK12基因表達(dá)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒別。結(jié)果倒置顯微鏡下可見(jiàn)小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞呈三角形和樹(shù)枝狀,細(xì)胞間連接明顯,可形成網(wǎng)狀連接；免疫熒光組織化學(xué)鑒定小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Vimentin陽(yáng)性；RT-PCR顯示Vimentin和Lumican基因表達(dá)陽(yáng)性,CK12表達(dá)陰性。結(jié)論Dispase酶消化法+組織塊法為體外獲得單純小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞提供了簡(jiǎn)單高效的途徑。 第三部分 基因重組構(gòu)建真核Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc表達(dá)系統(tǒng)及其在小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá) 目的基因重組構(gòu)建具有穿膜活性的核轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc的真核表達(dá)系統(tǒng),將其轉(zhuǎn)染至小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞,檢測(cè)其在小鼠角膜角質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。方法利用重疊延伸PCR法重組目的基因構(gòu)建質(zhì)粒,測(cè)序檢測(cè)重組DNA序列是否克隆正確。確定正確序列后將其轉(zhuǎn)染至小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,轉(zhuǎn)染后第10d免疫組織化學(xué)鑒定其表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建質(zhì)粒PCDNA3.1-Sox2、PCDNA3.1-Oct4、PCDNA3.1-Klf4、PCDNA3.1-c-Myc;測(cè)序結(jié)果顯示對(duì)應(yīng)基因序列正確,可成功轉(zhuǎn)染至小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞中；引起細(xì)胞形態(tài)變化,熒光免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染后第10d其在小鼠角膜基質(zhì)中表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建4個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子的真核表達(dá)系統(tǒng),可轉(zhuǎn)染至小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞及引起細(xì)胞形態(tài)和表型的變化,本研究為真核重組外源蛋白誘導(dǎo)角膜基質(zhì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為IPS細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2766758