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抗甘膽酸的重組單鏈抗體制備與免疫分析方法研究

發(fā)布時(shí)間:2020-07-22 20:32
【摘要】:甘膽酸(glycocholicacid,GCA),屬于二級(jí)膽酸,是類固醇酸的衍生物,由膽酸和甘氨酸在肝臟中結(jié)合生成的結(jié)合型膽酸,是膽汁酸的主要成分之一。GCA具有促進(jìn)脂類乳化,加速脂類物質(zhì)的消化和吸收的作用。GCA在血液和尿液中的濃度高低與肝細(xì)胞損害及膽汁酸代謝障礙的嚴(yán)重程度相關(guān)。因此,建立GCA的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)可以為各類肝臟疾病的鑒別、診斷、治療和預(yù)后分析提供重要的依據(jù)。目前,GCA的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、免疫學(xué)分析法等等。免疫分析法基于抗體和抗原之間特異性結(jié)合,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單、快速和便宜等優(yōu)點(diǎn),特別適用于大批量樣本的篩查?贵w是影響免疫分析方法特異性和靈敏性的重要因素之一。傳統(tǒng)的抗體包括多克隆抗體(polyclonal antibodies,pAb)和單克隆抗體(monoclonal antibodies,mAb);然而,這兩種抗體存在著某些缺點(diǎn),例如在多克隆抗體制備中批次與批次之間的差異;在單克隆抗體制備中耗時(shí)、生產(chǎn)成本高和步驟復(fù)雜等等。通過噬菌體展示技術(shù),可以從抗體文庫(kù)中淘選到具有高親和力的重組抗體,并可通過測(cè)序獲得抗體的編碼序列。單鏈抗體(single-chian variable fragment,scFv)是最常見的重組抗體之一,是能夠保持與抗原有效結(jié)合的最小單位,由輕鏈和重鏈可變區(qū)通過一段編碼連接肽基因拼接后表達(dá)的重組蛋白。ScFv抗體具有易于原核表達(dá)和基因工程改造等優(yōu)點(diǎn),目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、疾病治療、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全分析等領(lǐng)域。本研究以GCA為靶標(biāo),通過噬菌體展示技術(shù)篩選到了高親和力的scFv抗體,主要研究結(jié)果如下:1.噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)的構(gòu)建和淘選1.1通過完全抗原GCA-BSA對(duì)母雞進(jìn)行免疫,構(gòu)建了庫(kù)容量為3.34 × l07cfu的噬菌體scFv抗體文庫(kù)。利用GCA標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)洗脫的方式,進(jìn)行了四輪條件苛刻的淘選后,通過phage-ELISA的方法對(duì)淘選后的抗體文庫(kù)進(jìn)行鑒定,對(duì)篩選到的陽性克隆子進(jìn)行DNA測(cè)序分析,共獲得4種具有高親和力scFv的序列。2.抗GCA特異性單鏈抗體的原核表達(dá)及應(yīng)用2.1將靈敏度最高的噬菌粒scFv-G11進(jìn)行原核表達(dá)和純化,建立了基于scFv抗體檢測(cè)尿液中GCA的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA,靈敏度(IC50)為0.06 μg/mL,線性范圍(IC20~I(xiàn)C80)為 0.02~0.18 μg/mL,最低檢測(cè)限(limit of detection,LOD)為 0.01 μg/mL,與 TCA 的交叉反應(yīng)率為40%,與其它結(jié)構(gòu)類似的膽酸的交叉反應(yīng)率均低于0.58%。在尿液中的添加回收率為86~123%,并將檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示兩者具有良好的相關(guān)性(R2=0.99)。3.生物素化單鏈抗體的制備及應(yīng)用3.1分別通過化學(xué)法和酶催化法,將生物素標(biāo)記scFv抗體。結(jié)果顯示,酶催化生物素法標(biāo)記scFv抗體所建立的ELISA具有更高的靈敏性。利用酶催化法標(biāo)記的scFv抗體建立了間接競(jìng)爭(zhēng)BA-ELISA,IC50值為0.42μg/mL,線性范圍(IC20~I(xiàn)C80)為0.14~1.24μg/mL,檢測(cè)限LOD為0.07μg/mL,與TCA的交叉反應(yīng)率為43.75%,與其它結(jié)構(gòu)類似的膽酸的交叉反應(yīng)率均低于1.88%。在尿液中的添加回收率為110.8~125.6%,檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示兩者相關(guān)性良好(R2= 0.99)。綜上所述,本研究利用噬菌體展示技術(shù)篩選到了 4個(gè)高靈敏度的scFv抗體。此外,將具有較高靈敏度的scFv抗體,通過酶催化法,將生物素標(biāo)記到scFv抗體。通過scFv抗體和生物素化的scFv抗體,分別建立了 ELISA和BA-ELISA檢測(cè)方法。本研究建立的免疫學(xué)分析方法可以對(duì)GCA進(jìn)行有效的檢測(cè),對(duì)肝功能的監(jiān)控具有重要的意義。
【學(xué)位授予單位】:廣東工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2018
【分類號(hào)】:R392

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1 ;Antitumor effects of an engineered and energized fusion protein consisting of an anti-CD20 scFv fragment and lidamycin[J];Science China(Life Sciences);2011年03期

2 ;Theoretical Design of Catalytic Domain of Abzyme Se-scFv2F3 by Introducing a Catalytic Triad[J];Chemical Research in Chinese Universities;2010年01期

3 劉靜;肖代雯;周小鷗;文雪;代紅;王志華;沈昕;代維;楊道鋒;沈關(guān)心;;Preparation and Identification of scFv and bsFv against Transferrin Receptor[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2008年06期

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5 朱麗娟;廖雯君;朱慧芬;雷萍;王志華;邵靜芳;張悅;沈關(guān)心;;Construction,Expression and In Vitro Biological Behaviors of Ig scFv Fragment in Patients with Chronic B Cell Leukemia[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2006年02期

6 侯俊然,何藹,詹希美;ScFv噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)研究進(jìn)展及其在寄生蟲學(xué)上的應(yīng)用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2005年04期

7 ;Generation and Characterization of C305,a Murine Neutralizing scFv Antibody That Can Inhibit BLyS Binding to Its Receptor BCMA[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年06期

8 ;Recombinant scFv Antibodies against E Protein and N Protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Virus[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2004年08期

9 楊章民,司履生,王一理,來寶長(zhǎng);DESIGN OF ANTI-CD3 ScFv-B7.1 FUSION MOLECULE AND PREDICTION OF ITS BIOLOGICAL CHARACTERISTICS[J];Academic Journal of Xi'an Jiaotong University;2002年02期

10 ;Expression and bioactivity identification of soluble MG_7 scFv[J];World Journal of Gastroenterology;2002年01期

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3 ;Construction,Expression and Activity Identification of anti-LMP1scFv/tP Fusion Protein[A];2008年全國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要[C];2008年

4 李成龍;余清;于雪芝;溫凱;張素霞;王戰(zhàn)輝;;伏馬毒素單鏈抗體制備及其識(shí)別機(jī)制初步研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會(huì)第十一屆會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)討論會(huì)與中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

5 ;Construction of Fusion Protein scFv-PhoA for the Immunodetection of DON[A];2005全國(guó)第二屆核酸疫苗研討會(huì)論文集[C];2005年

6 Mengming Hu;Jun Zhang;Junting Yang;Yue Cao;Jinshun Qi;;A novel anti-Aβ scFv reduces Aβ plaques and inflammatory cytokines in the brain of APP/PS1 transgenic mice[A];中國(guó)神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2017年

7 ;Construction of an Anti-human Melanoma Immunocytokine ScFv-mTNF-α and Study on its Anti-tumor Effects[A];2008年全國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要[C];2008年

8 孔登;王小柯;邢秋翠;陳永;付新華;王守訓(xùn);;mms13、ScFv(3G11)及其融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)[A];第八屆全國(guó)醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)第五屆全國(guó)臨床應(yīng)用生物化學(xué)與分子生物學(xué)2013華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2013年

9 Zhujun Wang;Yuanyuan Chen;Sisi Li;Yuping Chen;Haizhao Zhao;Ming Jia;Zebin Luo;Yongmin Tang;;Successful construction and stable expression of an anti-CD45RA scFv-EGFP fusion protein in Chinese hamster ovary cells[A];2013年國(guó)家級(jí)“惡性血液系統(tǒng)疾病診治新進(jìn)展”學(xué)習(xí)班暨學(xué)術(shù)年會(huì)資料匯編[C];2013年

10 張果;崔恒;昌曉紅;成夜霞;付天云;石菁菁;李巍;;重組6B11ScFv/Hsp70融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及活性測(cè)定[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第一屆全球華人婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)大會(huì)暨第三次全國(guó)婦產(chǎn)科中青年醫(yī)師學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

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4 李月紅;抗ICAM-1單克隆抗體與單鏈抗體的制備及其生物學(xué)特性研究[D];吉林大學(xué);2005年

5 李亮;抗Ⅳ型膠原酶單抗scFv片段與力達(dá)霉素構(gòu)建的基因工程強(qiáng)化融合蛋白及其抗腫瘤作用的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2003年

6 羅良生;抗人腦膠質(zhì)瘤重組免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40及人源化抗CD3單鏈抗體在大腸桿菌中的表達(dá)[D];蘇州大學(xué);2000年

7 鄧健蓓;人AFP免疫小鼠全套單鏈抗體基因文庫(kù)的構(gòu)建篩選及其基因序列分析和表達(dá)的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1995年

8 閻巖;抗HFRS病毒鼠源性McAb 1A8噬菌體ScFv的表達(dá)與人源性抗體ScFv噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1998年

9 彭國(guó)平;CTLA-4單鏈抗體與HBsAg共修飾的DC疫苗抗HBV免疫的研究[D];浙江大學(xué);2008年

10 高冬梅;SIEA26-28 ku-scFv抗日本血吸蟲病治療性疫苗的免疫靶向作用及其效果的研究[D];中南大學(xué);2010年

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1 呂欣欣;重組免疫毒素Gigantoxin-4-4D5 scFv的制備、體外活性研究及鏈接優(yōu)化[D];華東理工大學(xué);2016年

2 何志娟;Anti-CD28 scFv-C_H3-KCCYSL的分子克隆、表達(dá)及活性鑒定[D];南京師范大學(xué);2012年

3 張曉;米爾比霉素肟化物ScFv噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建[D];南京師范大學(xué);2007年

4 張曉霞;抗亞洲I型口蹄疫病毒單鏈抗體的表達(dá)與純化[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

5 Khalissa Deffar;[D];東北師范大學(xué);2009年

6 陳輝;抗乙酰膽堿受體scFv基因克隆與表達(dá)的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

7 于佳;產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素表達(dá)、純化及人源scFv抗體篩選[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 閆潔;HLA-A2/CD35scFv融合蛋白在昆蟲桿狀病毒載體系統(tǒng)中的表達(dá)與純化[D];華中科技大學(xué);2009年

9 洪智慧;~(131)Ⅰ標(biāo)記抗胃泌素釋放肽前體單鏈抗體scFv的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2011年

10 楊海強(qiáng);抗Aβ單鏈抗體的桿狀病毒表達(dá)及其干預(yù)Aβ體外聚集的機(jī)制研究[D];北京交通大學(xué);2014年



本文編號(hào):2766303

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