【摘要】：甘膽酸(glycocholicacid,GCA),屬于二級(jí)膽酸,是類固醇酸的衍生物,由膽酸和甘氨酸在肝臟中結(jié)合生成的結(jié)合型膽酸,是膽汁酸的主要成分之一。GCA具有促進(jìn)脂類乳化,加速脂類物質(zhì)的消化和吸收的作用。GCA在血液和尿液中的濃度高低與肝細(xì)胞損害及膽汁酸代謝障礙的嚴(yán)重程度相關(guān)。因此,建立GCA的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)可以為各類肝臟疾病的鑒別、診斷、治療和預(yù)后分析提供重要的依據(jù)。目前,GCA的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、免疫學(xué)分析法等等。免疫分析法基于抗體和抗原之間特異性結(jié)合,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單、快速和便宜等優(yōu)點(diǎn),特別適用于大批量樣本的篩查�？贵w是影響免疫分析方法特異性和靈敏性的重要因素之一。傳統(tǒng)的抗體包括多克隆抗體(polyclonal antibodies,pAb)和單克隆抗體(monoclonal antibodies,mAb);然而,這兩種抗體存在著某些缺點(diǎn),例如在多克隆抗體制備中批次與批次之間的差異;在單克隆抗體制備中耗時(shí)、生產(chǎn)成本高和步驟復(fù)雜等等。通過噬菌體展示技術(shù),可以從抗體文庫(kù)中淘選到具有高親和力的重組抗體,并可通過測(cè)序獲得抗體的編碼序列。單鏈抗體(single-chian variable fragment,scFv)是最常見的重組抗體之一,是能夠保持與抗原有效結(jié)合的最小單位,由輕鏈和重鏈可變區(qū)通過一段編碼連接肽基因拼接后表達(dá)的重組蛋白。ScFv抗體具有易于原核表達(dá)和基因工程改造等優(yōu)點(diǎn),目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、疾病治療、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全分析等領(lǐng)域。本研究以GCA為靶標(biāo),通過噬菌體展示技術(shù)篩選到了高親和力的scFv抗體,主要研究結(jié)果如下:1.噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)的構(gòu)建和淘選1.1通過完全抗原GCA-BSA對(duì)母雞進(jìn)行免疫,構(gòu)建了庫(kù)容量為3.34 × l07cfu的噬菌體scFv抗體文庫(kù)。利用GCA標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)洗脫的方式,進(jìn)行了四輪條件苛刻的淘選后,通過phage-ELISA的方法對(duì)淘選后的抗體文庫(kù)進(jìn)行鑒定,對(duì)篩選到的陽性克隆子進(jìn)行DNA測(cè)序分析,共獲得4種具有高親和力scFv的序列。2.抗GCA特異性單鏈抗體的原核表達(dá)及應(yīng)用2.1將靈敏度最高的噬菌粒scFv-G11進(jìn)行原核表達(dá)和純化,建立了基于scFv抗體檢測(cè)尿液中GCA的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA,靈敏度(IC50)為0.06 μg/mL,線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為 0.02～0.18 μg/mL,最低檢測(cè)限(limit of detection,LOD)為 0.01 μg/mL,與 TCA 的交叉反應(yīng)率為40%,與其它結(jié)構(gòu)類似的膽酸的交叉反應(yīng)率均低于0.58%。在尿液中的添加回收率為86～123%,并將檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示兩者具有良好的相關(guān)性(R2=0.99)。3.生物素化單鏈抗體的制備及應(yīng)用3.1分別通過化學(xué)法和酶催化法,將生物素標(biāo)記scFv抗體。結(jié)果顯示,酶催化生物素法標(biāo)記scFv抗體所建立的ELISA具有更高的靈敏性。利用酶催化法標(biāo)記的scFv抗體建立了間接競(jìng)爭(zhēng)BA-ELISA,IC50值為0.42μg/mL,線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為0.14～1.24μg/mL,檢測(cè)限LOD為0.07μg/mL,與TCA的交叉反應(yīng)率為43.75%,與其它結(jié)構(gòu)類似的膽酸的交叉反應(yīng)率均低于1.88%。在尿液中的添加回收率為110.8～125.6%,檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示兩者相關(guān)性良好(R2= 0.99)。綜上所述,本研究利用噬菌體展示技術(shù)篩選到了 4個(gè)高靈敏度的scFv抗體。此外,將具有較高靈敏度的scFv抗體,通過酶催化法,將生物素標(biāo)記到scFv抗體。通過scFv抗體和生物素化的scFv抗體,分別建立了 ELISA和BA-ELISA檢測(cè)方法。本研究建立的免疫學(xué)分析方法可以對(duì)GCA進(jìn)行有效的檢測(cè),對(duì)肝功能的監(jiān)控具有重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：廣東工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2766303