【摘要】：背景:腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)指腦組織在經(jīng)歷較長時間缺血恢復血流灌注后,出現(xiàn)較再灌注前更嚴重的組織損傷和神經(jīng)功能障礙的過程。作為一種繼發(fā)性損傷,腦缺血再灌注后出現(xiàn)炎癥細胞的過度活化,炎癥介質(zhì)的大量釋放及細胞凋亡途徑的過度激活。但目前對腦缺血再灌注損傷的成因的研究眾說紛紜,其中興奮性氨基酸毒性損傷占據(jù)著重要地位。NMDA受體作為一種離子型谷氨酸受體,在興奮性氨基酸毒性中起重要作用,其對鈣離子具有高度的通透性,可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)作為第二信使的鈣離子濃度,影響多條信號通路的激活而介導細胞的死亡,如NMDA受體-CaMKⅡ通路。也可通過與自身連接形成如NMDA受體-DAPK1通路,NMDA受體-PSD95-nNOS通路等。NMDA受體激活還可加重再灌注后炎癥反應,繼而影響并決定了神經(jīng)元的死亡或存活,因此有學者認為抑制NMDA受體的活化對腦缺血再灌注后的病情轉(zhuǎn)歸有極大的意義。目的:(1)闡明腦缺血再灌注后NMDA受體活化加重腦損傷及炎癥反應;(2)探討在腦缺血再灌注時,ASIC1a的活動對NMDA受體介導腦損傷中炎癥反應的影響;(3)研究抑制ASIC1a活化對NMDA受體介導的腦損傷中炎癥反應的影響。方法:1.采用線栓法制作小鼠短暫性大腦中動脈栓塞再灌注(tMCAO)模型。通過TTC染色及神經(jīng)功能缺陷評分的方法,評定小鼠腦組織的損傷程度;ELISA的方法檢測炎癥因子IL-1 β的表達,蛋白質(zhì)免疫印跡法(WB)檢測p-NF-κB/NF-κB及NMDA受體的NR2A、NR2B亞基的蛋白含量及磷酸化的NR2A、NR2B的表達量。2.運用NMDA受體抑制劑氯胺酮(ketamine 100mg/kg)處理的tMCAO組,評定方法同上。3.WB檢測tMCAO模型中ASICla表達量然后在運用ASICla抑制劑阿米洛利(amiloride,l0mg/kg)、氟比洛芬(flurbiprofen,15mg/kg)處理的 tMCAO組,評定方法同上。4.運用膜片鉗技術(shù)記錄海馬CA1區(qū)的錐體細胞突觸后NMDA受體介導的興奮性電流(EPSCs),觀察NMDA受體抑制劑APV,ASICla特異性抑制劑PcTX1,ASICla非特異性抑制劑阿米洛利(amiloride)及新發(fā)現(xiàn)具抑制ASICla作用的非甾體類抗炎藥氟比洛芬(flurbiprofen)對NMDA EPSCs的作用。5.運用行為學曠場實驗、高架十字迷宮及強迫游泳觀察連續(xù)注射一周治療劑量ASICla抑制劑氟比洛芬與NMDA受體抑制劑氯胺酮對小鼠精神及行為的影響。結(jié)果:1.與假手術(shù)組相比,tMCAO可增加腦組織的損傷面積、神經(jīng)缺陷評分,增加炎癥因子TNF-α、IL-1 β、炎癥通路中p-NF-κB/NF-κB的表達量,增加NMDA受體的NR2A、NR2B亞基的蛋白含量及磷酸化的NR2A、NR2B的表達量。用NMDA受體抑制劑氯胺酮提前30mmin腹腔注射后可以抑制TNF-α及IL-1β活化、p-NF-κB/NF-κB的表達、腦組織的損傷面積及神經(jīng)功能缺陷評分。2.與假手術(shù)組相比較,tMCAO增加ASICla的表達量。而ASICla抑制劑提前30min腹腔注射后建立tMCAO模型或tMCAO后120min再運用ASICla抑制劑,均可抑制tMCAO后腦組織的損傷面積、神經(jīng)缺陷評分,氟比洛芬提前30min腹腔注射可減輕炎癥因子的產(chǎn)生及炎癥通路中p-NF-ΚB/NF-ΚB的表達量。減少NMDA受體的NR2B亞基的表達,而NR2A亞基及磷酸化的NR2A、NR2B的表達量未見明顯變化,甚至有所上升。3.膜片鉗技術(shù)結(jié)果顯示,NMDA EPSC的幅值可被PcTXl顯著減少,從灌流液中去除PcTXl后EPSCs恢復到原來大小。阿米洛利和氟比洛芬也有同樣的效果。4.NMDA受體抑制劑氯胺酮可造成小鼠焦慮與抑郁樣行為,而氟比洛芬鈉并無明顯影響。結(jié)論:腦缺血再灌注時,NMDA受體參與介導了腦損傷及炎癥反應同時,ASICla可能通過增加NMDA受體活化及表達,參與了腦缺血再灌注損傷及炎癥反應;ASICla抑制劑較NMDA受體抑制劑有更輕的精神副作用。
【學位授予單位】：濱州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743;R-332
【圖文】：

不僅ＮＭＤＡ受體的ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ蛋白含量表達上調(diào)，磷酸化的ＮＲ２Ａ（ｐ－逡逑ＮＲ２Ａ）及ＮＲ２Ｂ邋（ｐ－ＮＲ２Ｂ）蛋白含量表達也有增加。并且它們的表達在大腦中動逡逑脈栓塞再灌注２４ｈ還處于一個相對較高水平（圖１Ａ）。ｔＭＣＡＯ組（ｔＭＣＡＯ模擬腦逡逑缺血再灌注組）與ｓｈａｒａ組（假手術(shù)組）相比具有明顯的趨勢。逡逑接著我們進一步檢測ｔＭＣＡＯ模型中炎癥介質(zhì)ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－１０的表達，炎逡逑癥通路中ｐ－ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ／ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ的表達量評價炎癥反應的程度，并用神經(jīng)功能缺陷逡逑評分及ＴＴＣ染色方法評價腦損傷的程度。結(jié)果顯示模型中炎癥介質(zhì)ＴＮＦ－ａ及逡逑ＩＬ－１Ｐ、ｐ－ＮＦ－ｋＢ／ＮＦ－ｋＢ的表達（圖１Ｂ）、神經(jīng)功能缺陷評分均增加，ＴＴＣ染逡逑色并計算腦梗死的面積也增加（圖１Ｃ）邋，邋ＨＥ染色死亡細胞增加（圖ＩＤ）。ｔＭＣＡＯ逡逑組與ｓｈａｍ組相比，差異明顯。逡逑然后我們在ｔＭＣＡＯ模型建立前３０分鐘提前運用氯胺酮處理，于２４小時后逡逑提取細胞膜蛋白及突觸后膜蛋白，ＷＢ檢測其中ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ及磷酸化的ＮＲ２Ａ邋（ｐ－逡逑ＮＲ２Ａ）、ＮＲ２Ｂ邋（ｐ－ＮＲ２Ｂ）蛋白含量。結(jié)果顯示：ＮＭＤＡ受體抑制劑氯胺酮預處理后

蛋白印跡技術(shù)（ＷＢ）結(jié)果顯示，短暫性大腦中動脈栓塞模擬腦缺血再灌注逡逑的模型中，ＡＳＩＣｌａ蛋白含量表達上調(diào)，并且它們的表達在大腦中動脈栓塞再灌逡逑注２４ｈ還處于一個相對較高水平（圖２Ａ）。ｔＭＣＡＯ組（ｔＭＣＡＯ模擬腦缺血再灌注逡逑組與邋ｓｈａｍ組假手術(shù)組相比差異具有統(tǒng)計學意義ｐ＜０．邋０５）。然后在ｔＭＣＡＯ逡逑模型建立前３０分鐘預防性或（和）ｔＭＣＡＯ模型建立后２小時治療性運用ＡＳＩＣｌａ逡逑抑制劑處理，２４小時后通過ＴＴＣ染色及神經(jīng)功能缺陷評分的方法，評定小鼠腦逡逑組織的損傷程度；ＥＬＩＳＡ的方法檢測炎癥因子ＩＬ－１０的表達，ＷＢ檢測檢測口－逡逑ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ／ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ的表達量評定炎癥反應程度，結(jié)果顯示：邐運用兩種不同的逡逑ＡＳＩＣｌａ抑制劑進行預防性或治療性處理，即將實驗組分為四小組：逡逑１？阿米洛利預防性用藥（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ邋ｐｒｅ＿３０ｍｉｎ）；逡逑２－阿米洛利治療性性用藥（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ邋ｐｏｓｔ－３０ｍｉｎ）；逡逑３．

圖３邋ＡＳＩＣｌａ通過調(diào)節(jié)ＮＭＤＡ受體參與腦缺血再灌注損傷Ａ．與短暫性大腦中動脈栓塞逡逑（ｔＭＣＡＯ）模擬腦缺血再灌注組相比，ＡＳＩＣｌａ抑制劑氟比洛芬（ｆｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎ）降低了邋ＮＭＤＡ逡逑受體的ＮＲ２Ｂ亞基的蛋白的表達量。但ＮＲ２Ａ亞基及磷酸化的ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ的表達量與模型逡逑，。．

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