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建立人外周血單個(gè)核細(xì)胞來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

發(fā)布時(shí)間:2020-07-20 11:36
【摘要】:目的:誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSCs)具有細(xì)胞來源廣、可直接從病人自身獲得、在體外可誘導(dǎo)分化為造血祖細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。本文探討了如何建立了正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,為后期建立兒童遺傳性血液病的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞庫(kù)奠定基礎(chǔ)。方法:收集正常人外周靜脈血,采用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficollhypaque)密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,后將含有OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染單個(gè)核細(xì)胞,最后使轉(zhuǎn)染病毒后的單個(gè)核細(xì)胞接種于由小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)組成的飼養(yǎng)層細(xì)胞上,通過觀察形態(tài)學(xué)變化、TRA1-60活體染色、RTPCR對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:外周血單個(gè)核細(xì)胞在轉(zhuǎn)染仙臺(tái)病毒后15天,干細(xì)胞樣克隆開始逐漸形成,24天后可見大的圓形或橢圓形樣、邊界清晰的干細(xì)胞樣克隆;細(xì)胞活體染色發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可表達(dá)干細(xì)胞特異表面抗原TRA1-60,RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可表達(dá)干細(xì)胞多能性相關(guān)基因Lin28、OCT4和Nanog。結(jié)論:將含有OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)入人外周血單個(gè)核細(xì)胞,可以產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,其形態(tài)特征與胚胎干細(xì)胞(ES)相似,可表達(dá)干細(xì)胞特異抗原TRA1-60,同時(shí)也表達(dá)干細(xì)胞多能性相關(guān)基因。這些結(jié)果為課題組后期建立兒童遺傳性血液病誘導(dǎo)多能干細(xì)胞庫(kù)以及同OP9系統(tǒng)共培養(yǎng)使其體外分化為造血祖細(xì)胞提供技術(shù)參考。
【學(xué)位授予單位】:重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2018
【分類號(hào)】:R329.2
【圖文】:

形態(tài)圖,外周血單個(gè)核細(xì)胞,形態(tài),仙臺(tái)病毒


圖 1 外周血單個(gè)核細(xì)胞形態(tài)Fig 1 the morphology of PBMC.2 仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生 iPSCs.2.1 感染仙臺(tái)病毒外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)第 4 天,感染仙臺(tái)病毒。感染后第 3 天接種至飼養(yǎng)層EF 細(xì)胞上,六孔板每孔接種轉(zhuǎn)染后細(xì)胞 1×104-5×104個(gè)。使用 PBMC 培養(yǎng)基每換液并觀察細(xì)胞形態(tài)變化情況,轉(zhuǎn)染病毒 5 天后,可見外周血單個(gè)核細(xì)胞增大。轉(zhuǎn)病毒 3 天(×100) 轉(zhuǎn)病毒 5 天(×100)

外周血單個(gè)核細(xì)胞,感染后,仙臺(tái)病毒,細(xì)胞


圖 1 外周血單個(gè)核細(xì)胞形態(tài)Fig 1 the morphology of PBMC.2 仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生 iPSCs.2.1 感染仙臺(tái)病毒外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)第 4 天,感染仙臺(tái)病毒。感染后第 3 天接種至飼養(yǎng)層EF 細(xì)胞上,六孔板每孔接種轉(zhuǎn)染后細(xì)胞 1×104-5×104個(gè)。使用 PBMC 培養(yǎng)基每換液并觀察細(xì)胞形態(tài)變化情況,轉(zhuǎn)染病毒 5 天后,可見外周血單個(gè)核細(xì)胞增大。轉(zhuǎn)病毒 3 天(×100) 轉(zhuǎn)病毒 5 天(×100)

干細(xì)胞,細(xì)胞


圖 3 干細(xì)胞樣克隆開始形成(×100)Fig 3 stem cell like clones begin to emerge.2.3 干細(xì)胞樣克隆與胚胎干細(xì)胞形態(tài)相似感染病毒后第 24 天,克隆增大,呈圓形或橢圓形樣,島狀,邊界與飼養(yǎng)分界清晰,克隆內(nèi)有小的細(xì)胞生長(zhǎng),排列致密,細(xì)胞間分界不清,形態(tài)與細(xì)胞相似(圖 4)。A 與 C 為同一細(xì)胞,B 與 D 為同一細(xì)胞。

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