發(fā)布時(shí)間：2020-07-20 11:06

【摘要】：目的:通過建立單個(gè)T細(xì)胞的分離和基因擴(kuò)增技術(shù),來獲取識(shí)別特定抗原表位肽的單個(gè)T細(xì)胞的TCR基因,為特異性TCR的獲取提供了一種新方法,為以后獲取腫瘤特異性TCR基因并利用特異性TCR基因修飾T細(xì)胞進(jìn)行過繼性免疫治療打下基礎(chǔ)。方法:一、單個(gè)淋巴細(xì)胞的手工顯微分離及單細(xì)胞水平的RT-PCR擴(kuò)增利用自制的毛細(xì)玻璃管、橡膠管和濾嘴組裝成一套完整的單細(xì)胞分離工具,通過該分離工具分離出單個(gè)T淋巴細(xì)胞,然后使用不同的試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和GAPDH基因擴(kuò)增,通過對(duì)比確定出擴(kuò)增效率高的反轉(zhuǎn)錄試劑盒,并通過擴(kuò)增BCL2、STAT1和CD8a基因進(jìn)一步驗(yàn)證其擴(kuò)增效率,優(yōu)化其相應(yīng)擴(kuò)增條件,為擴(kuò)增單個(gè)T淋巴細(xì)胞的TCR基因奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。二、單個(gè)T細(xì)胞TCRA基因擴(kuò)增方法的建立通過自制的手工分離單細(xì)胞工具分離出單個(gè)經(jīng)特定富集的CD8~+T細(xì)胞后,分別采用5’RACE法和多重PCR法擴(kuò)增單個(gè)T細(xì)胞的TCRA基因。通過采用不同的擴(kuò)增條件、不同的特異性引物和不同的PCR擴(kuò)增酶進(jìn)行5’RACE法擴(kuò)增TCRA基因條件的摸索;通過常規(guī)PCR和分步PCR法進(jìn)行多重PCR法擴(kuò)增TCRA基因的條件摸索。三、TCR(α和β鏈)重組表達(dá)載體的構(gòu)建將第二部分單細(xì)胞擴(kuò)增獲得的TCR基因核心序列(CDR3)分別與對(duì)應(yīng)的上游V區(qū)和下游C區(qū)片段通過融合PCR的方法拼接出全長(zhǎng)序列。然后根據(jù)插入的目的基因和載體序列設(shè)計(jì)合理的同源重組引物和含酶切位點(diǎn)引物進(jìn)行TCRα和TCRβ基因的擴(kuò)增,后與pIRES2-Oligo載體連接,構(gòu)建出TCR的重組表達(dá)載體。結(jié)果:一、成功組裝單細(xì)胞分離工具并建立了手工顯微分離單個(gè)T淋巴細(xì)胞的方法;通過對(duì)單個(gè)T細(xì)胞豐度較高的GAPDH基因擴(kuò)增,摸索出了穩(wěn)定的單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增方法,并通過擴(kuò)增單個(gè)T細(xì)胞的BCL2、STAT1和CD8a基因得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證,為擴(kuò)增單個(gè)T細(xì)胞的TCR基因奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。二、5’RACE法擴(kuò)增單個(gè)T細(xì)胞的TCRA基因效果不理想。后對(duì)多重PCR擴(kuò)增單個(gè)T細(xì)胞TCRA基因的方法進(jìn)行優(yōu)化,成功擴(kuò)增出2個(gè)CD8~+T細(xì)胞各自的TCRA基因:1號(hào)細(xì)胞的TCRVα16和TCRVα2/3、4號(hào)單細(xì)胞的TCRVα26和TCRVα1/5。三、通過融合PCR法成功擴(kuò)增出TCRβ5、TCRα1/5和TCRα26的全長(zhǎng)序列。利用同源重組和酶切的方法成功構(gòu)建出pIRES2-TCRβ5-TCRα1/5和pIRES2-TCRβ5-TCRα26重組表達(dá)載體。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功建立了單個(gè)T淋巴細(xì)胞的手工顯微分離和基因擴(kuò)增方法,在此基礎(chǔ)上通過對(duì)單細(xì)胞TCR基因的方法摸索,成功建立了分步多重PCR擴(kuò)增單個(gè)T細(xì)胞TCR基因的方法。該技術(shù)的建立為快速獲取TCR-T細(xì)胞免疫治療所需的特異性TCR基因提供了新的方法與思路,為促進(jìn)TCR-T過繼性細(xì)胞免疫療法的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

也會(huì)有不同數(shù)量的核苷酸隨機(jī)插入 V 區(qū)與 J 區(qū)、V 區(qū)與 D 區(qū),D 區(qū)與 J 區(qū)，形成VN(DN)J 的重排，從而又增加了 TCR 的多樣性。最后不同的 和 β 鏈自由組合更增加了 TCR 的多樣性，據(jù)理論估算可達(dá)到 1016以上，這也很好的解釋了 T 細(xì)胞能夠識(shí)別多種抗原的原因。TCR的 V區(qū)基因編碼了CDR1、CDR2和部分CDR3區(qū)，VN(DN)J 連接區(qū)稱之為 CDR3 區(qū)，它是識(shí)別抗原肽的關(guān)鍵區(qū)域[9]。通常我們只需得到特異性 T 細(xì)胞的 CDR3 區(qū)，根據(jù) CDR3 區(qū)的部分 V 區(qū)和 C 區(qū)片段分析可得到 和 β 鏈的全長(zhǎng)序列。每個(gè) T 細(xì)胞的 和 β 鏈分別對(duì)應(yīng)一個(gè) CDR3 區(qū)，由 和 β 的 CDR3 區(qū)共同決定了識(shí)別抗原的特異性，通過 CDR3 序列可以判斷 T細(xì)胞是否來自同一克隆或不同克隆。經(jīng)過抗原刺激 TCR 譜系會(huì)出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)選擇，即識(shí)別該抗原的 T 細(xì)胞進(jìn)行克隆性增殖[10]。通常多數(shù)研究只通過分析 TCRVβ 譜系來了解 TCR 選用和偏移情況，他們認(rèn)為 Vβ 在抗原刺激后所引起的限制性更為明顯，但也有學(xué)者認(rèn)為 TCRV 的限制性出現(xiàn)更早，但有研究發(fā)現(xiàn)存在許多優(yōu)勢(shì)利用和優(yōu)勢(shì)配對(duì)情況，如 HLA-A2/Melan-A 特異的 CD8+T 細(xì)胞的 V 2.1NJ 35和 Vβ14.1 的選用和配對(duì)頻率最高[11]，這也提示了在對(duì)抗原特異的 TCR 譜系研究中，可能需要同時(shí)分析 TCR 和 TCRβ 譜系，才能獲得更為全面和客觀的結(jié)果。

圖 2 TCR β 基因的重排Fig.2 The rearrangement of TCR β genesCR 研究是利用 和 β 各亞家族相應(yīng)單克隆抗體進(jìn)行流各亞家族的分布與缺失進(jìn)行研究。然而流式細(xì)胞術(shù)雖和 β 鏈各亞家族的表達(dá)并對(duì)其準(zhǔn)確定量，卻無法明確布，所以PCR-DNA印跡法[12]、PCR-變性聚丙烯酰胺凝性[14]、熒光定量 PCR 溶解曲線法[15]等方法應(yīng)運(yùn)而出CR 和 β 鏈 CDR3 多態(tài)性和長(zhǎng)度分布。此后，有學(xué)者 TCRV 和 Vβ 基因家族同源性的特點(diǎn)研發(fā)了免疫掃疫指紋分析技術(shù) )，其基本策略為依據(jù) Vβ24 和 V 32 設(shè)計(jì)各家族相應(yīng)的特異性上游引物，并在 TCR 和 β 和 TCRAC 下游引物，由于不同 T 細(xì)胞克隆其 TCR C，利用 PCR 技術(shù)可擴(kuò)增出所有 TCRV 和 TCRVβ 家族

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本文編號(hào)：2763362