【摘要】：肺炎衣原體(Chlamydia pneumonia,Cpn)是一種重要的非典型病原體,�？梢鸱窝住⒅夤苎椎群粑到y(tǒng)疾病,也有研究表明其與心內(nèi)膜炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等肺外疾病密切相關(guān)。肺炎衣原體感染宿主細(xì)胞后,主要依靠包涵體提供生存環(huán)境和所需營養(yǎng),逃避宿主免疫。包涵體膜蛋白作為包涵體的重要組成部分,承擔(dān)著重要的生物學(xué)功能,引起研究者高度關(guān)注。Cpn0308是已經(jīng)實(shí)驗研究證實(shí)的包涵體膜蛋白,但其生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。前期實(shí)驗運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)初步篩選出了與Cpn0308相互作用的分子為乙酰輔酶A結(jié)合域蛋白3(Acyl-coenzyme A binding domain-containing 3,ACBD3),本研究利用免疫共沉淀技術(shù)、GST pull-down技術(shù)和亞細(xì)胞共定位技術(shù)對兩者間的相互作用做進(jìn)一步鑒定。首先,以He La細(xì)胞c DNA為模板,根據(jù)前期酵母雙雜交實(shí)驗所得配體基因序列設(shè)計引物,通過PCR方法擴(kuò)增ACBD3基因片段,與pc DNA3.1+/Flag載體質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和T4連接酶連接,構(gòu)建真核表達(dá)載體pc DNA3.1+/Flag-ACBD3,并利用菌落PCR、雙酶切及質(zhì)粒測序的方法進(jìn)行質(zhì)粒篩選鑒定。然后,采用免疫共沉淀技術(shù),驗證Cpn0308與ACBD3間的相互作用。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法,將實(shí)驗室保存的pc DNA3.1/Myc-HisCpn0308和新構(gòu)建的pc DNA3.1+/Flag-ACBD3兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至He La細(xì)胞,培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞,離心裂解后加入Myc beads翻轉(zhuǎn)吸附過夜,通過western blot技術(shù)進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示在33.5k D和15k D處有兩條條帶,分別對應(yīng)為ACBD3和Cpn0308蛋白,證明兩種蛋白間存在相互作用。同時,利用GST pull-down技術(shù),分別制備誘餌蛋白GST-Cpn0308和獵物蛋白ACBD3,經(jīng)誘餌蛋白固定、獵物蛋白捕獲、洗滌等步驟后,通過western blot檢測,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗組存在39k D和33.5k D兩條條帶,分別對應(yīng)了GST-Cpn0308蛋白和ACBD3蛋白,進(jìn)一步確認(rèn)了兩種蛋白間的相互作用。最后,利用亞細(xì)胞共定位技術(shù),將pc DNA3.1/Myc-His-Cpn0308和pc DNA3.1+/Flag-ACBD3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至He La細(xì)胞,培養(yǎng)24h后進(jìn)行丙酮固定,以兔抗Myc抗體和鼠抗Flag抗體作為一抗,羊抗鼠Ig G-Cy3抗體、羊抗兔Ig G-FITC抗體作為二抗,對表達(dá)的融合蛋白Myc-Cpn0308和Flag-ACBD3進(jìn)行免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)Cpn0308顯綠色熒光,ACBD3顯紅色熒光,兩者融合顯黃色熒光,確認(rèn)外源性的兩種蛋白間存在相互作用�；谕瑯拥姆椒�,將pc DNA3.1/Myc-His-Cpn0308轉(zhuǎn)染至He La細(xì)胞,利用鼠抗Cpn0308抗體和兔抗ACBD3抗體作為一抗,羊抗小鼠Ig G-Cy3抗體、羊抗兔Ig G-FITC抗體作為二抗,進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗,發(fā)現(xiàn)Cpn0308顯紅色熒光,ACBD3顯綠色熒光,兩者融合顯黃色熒光,對Cpn0308蛋白和內(nèi)源性ACBD3間的相互作用進(jìn)行了鑒定。綜合以上實(shí)驗結(jié)果,證實(shí)了肺炎衣原體包涵體膜蛋白Cpn0308與ACBD3存在相互作用,為Cpn0308的生物學(xué)功能研究提供了依據(jù),并可能有助于對肺炎衣原體生長發(fā)育的分子機(jī)制的進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R374

【參考文獻(xiàn)】

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1 魯繼榮,王s

本文編號：2763101