【摘要】：目的1.分析兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)過程、步驟及結(jié)果。2.研究誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)所得血管內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌量的影響及意義。3.探討以家兔替代大鼠作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞供體和自體移植受體的可行性。實(shí)驗(yàn)方法一、選取3~4月齡的健康清潔級(jí)新西蘭大白兔進(jìn)行靜脈麻醉操作,麻醉完成后于右下肢股骨用骨髓穿刺針于穿刺點(diǎn)垂直骨面穿刺進(jìn)入骨髓腔,抽吸骨髓3ml,立即注入離心管中,充分混合成骨髓懸液。離心5min,去除上層的脂肪及組織液,收集管底的細(xì)胞。二、將收獲的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),將收獲的細(xì)胞用PBS液重懸,加入Percoll分離液中,進(jìn)行離心;吸取中間厚度約0.2cm的乳白色細(xì)胞層,洗滌后再用培養(yǎng)液重懸;細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度后以接種于塑料培養(yǎng)皿中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);定期換液,去除未貼壁細(xì)胞。三、原代培養(yǎng)完成后接種傳代培養(yǎng),待細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí),棄培養(yǎng)夜,清洗3次,加入0.125%胰蛋白酶消化后,光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,待細(xì)胞間隙擴(kuò)大,細(xì)胞呈不規(guī)則時(shí),終止消化;收集細(xì)胞懸液并離心,用含青-鏈霉素的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,再按1:2接種傳代。四、定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞選擇細(xì)胞性狀較穩(wěn)定,生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞棄去培養(yǎng)液并清洗,加入含青-鏈霉素、VEGF、b FGF的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液,定期換液。連續(xù)鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。五、流式細(xì)胞術(shù)鑒定取誘導(dǎo)培養(yǎng)的第三代血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD31、v WF的表達(dá)。細(xì)胞消化離心后,用PBS重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度后分別加入到3個(gè)流式管中并標(biāo)記為123,分別在123管中加入pbs、CD31、v WF,定容后上機(jī)鑒定。六、NO分泌量檢測(cè)取誘導(dǎo)培養(yǎng)第5d、第10d、第15d的上清液,按照Griess試劑說明書方法操作,應(yīng)用EXCEL繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將所測(cè)樣品吸光度代入計(jì)算NO分泌量,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較兩兩之間結(jié)果,以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、(1)原代細(xì)胞接種4h后可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),48h后換液時(shí)可見細(xì)胞集落生長(zhǎng),細(xì)胞呈梭形、三角形,10-12d后見細(xì)胞簇集,呈網(wǎng)狀、旋渦狀排列。傳代細(xì)胞接種后生長(zhǎng)迅速,培養(yǎng)5-6d后,呈長(zhǎng)梭形排列均勻。加入內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液后48h后,鏡下觀察可見部分細(xì)胞變?yōu)槎趟笮?誘導(dǎo)10 d后,細(xì)胞集簇生長(zhǎng),呈魚群樣排列;誘導(dǎo)20d后,可見內(nèi)皮樣細(xì)胞呈鋪路石狀排列細(xì)胞長(zhǎng)度增加,形態(tài)扁平(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示:誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞CD31陽性率97.3%±0.8%,v WF陽性率95.7%±1.1%。(3)檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)第5d、第10d和第15d后上清液中的NO分泌量,顯示:第5d上清液中NO分泌量為(31.25±2.67)μmol/L,第10d上清液NO分泌量為(65.88±3.64)μmol/L,第15d上清液中的NO分泌量為(86.31±3.93)μmol/L。二、對(duì)誘導(dǎo)分化獲得的血管內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌量采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較三組結(jié)果,t=26.574≥t(df)0.05,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。NO分泌量第5d第10d第15d。三、實(shí)驗(yàn)采用相同的VEGF+b FGF的誘導(dǎo)方案,成功獲得兔血管內(nèi)皮細(xì)胞,與課題組前期的大鼠實(shí)驗(yàn)研究得出一致的結(jié)果。結(jié)論1.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在VEGF與b FGF聯(lián)合誘導(dǎo)下分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。2.在誘導(dǎo)分化過程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞活性在15d內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加,從而使NO分泌量增加。3.家兔可以替代大鼠作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞供體和自體細(xì)胞移植的受體,可以通過誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞為自體細(xì)胞移植提供種子細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

呈網(wǎng)狀、旋渦狀排列。傳代細(xì)胞接種后生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng) 5-6d 后，呈長(zhǎng)梭形排列均勻，見圖1。加入內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液后 48h 后，鏡下觀察可見部分細(xì)胞變?yōu)槎趟笮�；誘導(dǎo) 10 d 后，細(xì)胞集簇生長(zhǎng)，呈魚群樣排列，見圖 2；誘導(dǎo) 20d 后，可見細(xì)胞呈 VECs 常見的鋪路石狀排列，細(xì)胞長(zhǎng)度增加，形態(tài)扁平，形似水流，見圖 3。3.2 第一代和第三代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)得的數(shù)據(jù)，應(yīng)用 EXCEl 作圖，見圖 4。P1 代和 P3 代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線相似呈現(xiàn)典型的“S” 形。細(xì)胞接種后的 24h 內(nèi)處于潛伏期，隨后開始分裂增殖，細(xì)胞數(shù)目增多，第 2-5d 細(xì)胞增殖速度較快

誘導(dǎo)培養(yǎng)10d第3代細(xì)胞×40Figure2cellsofpassage3culturedfor10days

第P1代和第P3代的生長(zhǎng)曲線

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 孔根現(xiàn);李麗;蔣知新;張清華;;兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定及向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2014年13期

2 何玉祥;孫巖;劉振川;劉洋;周華;王茂華;袁海;金星;吳學(xué)君;;大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分離、純化、培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J];解放軍醫(yī)藥雜志;2014年05期

3 丁洋;萬圣云;;體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究[J];安徽醫(yī)藥;2008年04期

本文編號(hào)：2759993