【摘要】：目的 構(gòu)建銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)重組Bb-OprI疫苗,研究其免疫小鼠后誘導(dǎo)的保護力和免疫機制。方法 PCR擴增OprI抗原編碼基因并將其定向克隆至原核表達載體pGEX-1λT,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-OprI。將pGEX-OprI電穿孔轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),SDS-PAGE和Western blot分析并鑒定表達產(chǎn)物。將重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifdum,Bb),SDS-PAGE和Western blot分析并鑒定表達產(chǎn)物。將重組Bb-OprI疫苗灌胃接種小鼠,以PA01株進行攻擊。分離肺臟和脾臟,檢測肺組織的細菌負荷,ELISA檢測血清抗體,MTT法檢測脾細胞增殖,流式細胞術(shù)驗證該疫苗對脾T淋巴細胞亞群分化和脾細胞凋亡的影響,PCR分析脾細胞因子和Treg變化。結(jié)果 成功擴增出194 bp的OprI基因,雙酶切和PCR鑒定證實OprI基因成功克隆入pGEX-1λT中,并且pGEX-OprI成功轉(zhuǎn)化BL21(DE3),BL21(pGEX-OprI)可表達Mr約32kDa的GST-OprI蛋白,Pa感染的鼠血清可識別該蛋白。pGEX-OprI成功轉(zhuǎn)化Bb,Bb-OprI疫苗可表達Mr約32 kDa的GST-OprI蛋白,該蛋白能被Pa感染的鼠血清識別。Bb-OprI疫苗接種及PA01株攻擊BALB/c鼠后,Bb-OprI組肺部的細菌負荷降低,疫苗組的血清抗體IgG、IgG2b、IgG3和IgE水平升高,脾細胞增殖和CD4+T細胞比例增加,脾細胞凋亡減少,疫苗組小鼠脾細胞可擴增出 IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10、IL-17 和 Foxp3 基因,兩對照組PCR擴增均陰性。結(jié)論 成功構(gòu)建了重組Bb-OprI疫苗,重組Bb-OprI疫苗可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生體液免疫、細胞免疫和免疫調(diào)節(jié)作用,從而抵抗Pa的感染并維持免疫穩(wěn)態(tài)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

１．１．１邋ＯｐｒＩ抗原編碼基因ＰＣＲ擴增產(chǎn)物鑒定逡逑．１．１邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＯｐｒＩ邋ｇｅｎＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－４：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＯｐｒＩ邋ｇｅｎｅＸ－Ｏｐｒｌ的雙酶切鑒定逡逑體為對照，具有Ａｍｐ抗性的重組菌酶切后產(chǎn)生約４邋９４７邋ｂｐ的ｐＧＥＸ－ＵＴ載．２）。逡逑

圖１．１．２ｐＧＥＸ－ＯｐｒＩ的雙酶切鑒定逡逑Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐＧｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｐＧＥＸ－Ｏｐｒｌ的ＰＣＲ鑒定逡逑的重組菌中抽提出的質(zhì)粒為模板進圖１．１．３）。逡逑Ｍ邋１邋２邋３邋４邋５邐６邋７邐８逡逑ｂｐ逡逑１０邋０００邋Ｗ逡逑２邋０００Ｋｆｌ逡逑１５０0Ｃ逡逑ｉ邋ｏｏｏＰ逡逑５０0ｌ逡逑

１０邋０００邋Ｆ逡逑５邋０００９４７逡逑２邋００0Ｂ逡逑ｉｏｏｏＥ逡逑２５０邐１９４逡逑圖１．１．２ｐＧＥＸ－ＯｐｒＩ的雙酶切鑒定逡逑．１．２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐＧＥＸ－Ｏｐｒｌ逡逑２：邋Ｄｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｐＧＥＸ－Ｏｐｒｌ；邋３ＥＸ－Ｏｐｒｌ的ＰＣＲ鑒定逡逑抗性的重組菌中抽提出的質(zhì)粒為模板進行ＰＣＲ，（圖１．１．３）。逡逑Ｍ邋１邋２邋３邋４邋５邐６邋７邐８逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2759843