【摘要】：人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是已確證可導致人類癌癥的病原體,持續(xù)感染HPV16等高危亞型會引起宮頸癌、口腔癌、直腸癌等癌癥的發(fā)生。HPV16的主要衣殼蛋白L1可在體外自組裝成為病毒樣顆粒(Virus-like particle,VLP),VLP高度模擬天然病毒的表面結構,具備刺激機體產生免疫反應的能力,且因不含有病毒核酸而具備良好的安全性。因此,開發(fā)基于HPV16L1 VLP的疫苗具有極大的潛力和應用價值。目前,已上市的預防性HPV疫苗有三種,有效降低了 HPV病毒的感染和宮頸癌等癌癥的發(fā)生,疫苗抗原刺激機體產生的中和抗體被認為是預防性疫苗的主要作用機制。疫苗的安全性和有效性是保證疫苗發(fā)揮保護作用的前提條件,因此,建立針對疫苗的質量分析方法對疫苗的研發(fā)、生產及免疫效果評估等具有重要意義。本研究旨在建立HPV16VLP疫苗的多表位免疫化學質量分析體系,利用多個識別抗原不同表位的單克隆抗體從多角度全方面的對疫苗抗原進行監(jiān)控,為HPV16 VLP疫苗的生命周期管理提供科學依據和保證,也為其他VLP疫苗質量分析體系的建立提供思路。首先,對HPV16L1VLP的鼠源單克隆細胞株進行了生產,經過純化后共獲得27株單克隆抗體,并對這些抗體的型別特異性、抗體亞類、與抗原的結合能力、對抗原構象變化的敏感性及假病毒中和活性等性質進行了分析和鑒定。其次,在對各單抗的性質有一定了解的基礎上,篩選出10株代表性單抗進行單抗相互阻斷及人血清阻斷實驗,并通過SPSS分析軟件對單抗的相互阻斷信息及與人血清阻斷的信息進行聚類分析,將單抗依據不同的結合表位區(qū)分為了 5類。然后綜合考慮單抗的性質鑒定信息,從5個表位區(qū)內進一步篩選出6株可能識別不同免疫優(yōu)勢表位的單抗用于HPV16疫苗的免疫化學質量分析。將上述篩選出的單抗用于構建基于無分子標記的表面等離子法(SPR法),基于抗原“溶液中”競爭的ELISA法(rIC50法)以及基于雙表位檢測的雙抗夾心ELISA法(rECso法)。通過對各實驗的實驗條件進行摸索優(yōu)化并對實驗的靈敏度和有效性進行考察,最終建立了基于6株單抗的SPR法、基于5株單抗的rIC50法和基于2株單抗的rEC50法,經驗證,基于各單抗建立的三種質量分析方法均具有良好的重現性和穩(wěn)健性。最后,本研究應用建立的免疫化學質量分析方法對本實驗室與廈門萬泰滄海生物技術有限公司聯合研制的HPV16VLP疫苗的免疫效果進行了評價并對疫苗生產工藝的改變進行了可比性分析。研究中,考察了疫苗抗原的發(fā)酵規(guī)模從100 L放大至500 L后的疫苗抗原性的變化情況。通過建立的SPR法和rIC50法對放大前后的疫苗抗原進行分析,發(fā)現發(fā)酵規(guī)模放大后的疫苗批次與對照疫苗的一致性良好,疫苗的免疫原性未發(fā)生明顯變化。綜上所述,本研究獲得了針對HPV16L1VLP的單克隆抗體盤,通過對單抗各項性質的分析鑒定和對單抗表位識別區(qū)的聚類分析,最終篩選出了代表性單抗作為疫苗抗原定量分析工具,建立了 HPV16VLP疫苗的多表位免疫化學質量分析體系,并將建立的疫苗質量分析方法應用于HPV16 VLP疫苗的免疫效果評價及生產工藝的可比性分析研究中。這種多表位正交非重疊的免疫化學質量分析系統的建立,為HPV16疫苗的安全性和有效性提供了保障,為疫苗的體外相對效價評估奠定了基礎,也為其它VLP疫苗的質量分析系統的建立提供了借鑒模式。
【學位授予單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

進行科學研宄［５＜）］。逡逑迄今為止被批準上市的ＶＬＰ疫苗有ＨＢＶ疫苗、ＨＰＶ疫苗和ＨＥＶ疫苗，ＶＬＰ逡逑疫苗的發(fā)展歷程如圖１．２所示。１９８６年，由美國默克公司（Ｍｅｒｃｋ）通過酵母表逡逑達系統研制的人類歷史上第一支ＶＬＰ疫苗邐重組乙肝疫苗Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ邋ＨＢ被逡逑批準上市［１６＞５１】。２０年后，Ｍｅｒｃｋ公司推出基于酵母真核表達系統的世界上第一逡逑支人乳頭瘤病毒四價預防性疫苗（ＨＰＶ１６／１８／６／１１）邋Ｇａｒｄａｓｉｌ？［５２］。２００９年，美國逡逑５逡逑

Ｆｉｇ．邋１．３邋ＨＰＶ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ１６７１逡逑．２．２宮頸癌疫苗簡介逡逑ＨＰＶ是經高度密切接觸傳播的病毒，目前己確證其是可導致人類癌癥的病逡逑原體。感染高危型ＨＰＶ而引起的惡性病變中，宮頸癌的發(fā)病率居于首位�，F在逡逑全球每年新增近５０萬宮頸癌新發(fā)病例，其中，僅中國每年大約有１０萬女性因感逡逑ＨＰＶ而患癌，亡約三萬［５８］。癌目前已展我國逡逑

需對抗原蛋白的三級結構和四級結構進行檢測［８１］。由于抗原蛋白是通過表面的逡逑關鍵有效表位來刺激機體產生免疫反應的，因此對抗原的表位進行表征也是疫苗逡逑免疫效果評價的指標，甚至可用來替代動物實驗［１７］。如圖１．６所示，以對ＨＰＶ逡逑疫苗Ｇａｒｄａｓｉｌ？抗原的分析為例，建立了針對抗原不同結構水平應用的不同的分逡逑１２逡逑

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