【摘要】：DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response,DDR)不僅是細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定性的基石,DNA損傷應(yīng)答缺陷更與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。而長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)作為目前研究的熱點(diǎn),現(xiàn)在已有眾多研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA在DNA損傷應(yīng)答的多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。且長(zhǎng)鏈非編碼RNA的失調(diào)與缺陷的DNA損傷應(yīng)答都與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),因此挖掘更多參與DNA損傷應(yīng)答的長(zhǎng)鏈非編碼RNA并深入揭示其在DNA損傷應(yīng)答中的功能和其參與DNA損傷應(yīng)答的分子機(jī)理,不僅能深化和豐富DNA損傷應(yīng)答的理論知識(shí),而且能極大加深我們對(duì)與之相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)理的理解,更能在理論上指導(dǎo)臨床治療和藥物研發(fā)。課題組前期通過(guò)高通量DNA芯片技術(shù)篩選出了多個(gè)可能參與DNA損傷應(yīng)答的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,本文研究其中的lncRNA0177和lncRNA1670,對(duì)它們?cè)贒NA損傷應(yīng)答中的功能做了初步研究。本文主要得到以下結(jié)論:(1)使用CPC、CPAT以及RNAfold等生物信息學(xué)工具對(duì)兩條RNA的編碼能力及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析,得出它們均不具有蛋白質(zhì)編碼能力,且均可能與DNA、蛋白質(zhì)等大分子發(fā)生相互作用;(2)核質(zhì)分布實(shí)驗(yàn)表明lncRNA0177主要分布在細(xì)胞的細(xì)胞核中;(3)人體細(xì)胞在紫外光造成DNA損傷后,lncRNA0177的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。而在應(yīng)答甲基磺酸甲酯(MMS)、阿霉素(DOX)和博來(lái)霉素(Bleomycin)造成的DNA損傷時(shí),lncRNA0177的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。其中在受到MMS造成的損傷后4 h轉(zhuǎn)錄上調(diào)到最大值,而在受到阿霉素和博來(lái)霉素造成的損傷后12 h轉(zhuǎn)錄達(dá)到峰值;(4)為了進(jìn)一步研究lncRNA0177是否參與了DNA損傷應(yīng)答,本文利用RNA干擾(RNAi)的原理構(gòu)建了lncRNA0177敲降單克隆細(xì)胞株和僅含敲降載體的對(duì)照細(xì)胞株。數(shù)據(jù)表明,在受到紫外光輻射引起的DNA損傷后,敲降lncRNA0177對(duì)細(xì)胞的生存率影響不顯著,但在受到MMS和阿霉素引起的DNA損傷后,敲降lncRNA0177后細(xì)胞的生存率顯著下降;(5)lncRNA1670在細(xì)胞受到紫外光造成的DNA損傷后轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào),并在受到DNA損傷刺激后8 h達(dá)到最大值。在應(yīng)答MMS造成的DNA損傷時(shí),lncRNA1670的轉(zhuǎn)錄也顯著上調(diào),但在受到損傷后4 h轉(zhuǎn)錄上調(diào)達(dá)到最大值;(6)為了進(jìn)一步研究lncRNA1670在DNA損傷應(yīng)答中的作用,采取同樣的實(shí)驗(yàn)手段,構(gòu)建了lncRNA1670敲降單克隆細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)表明敲降lncRNA1670會(huì)影響人體細(xì)胞經(jīng)紫外光輻射和MMS處理后的生存率但不影響人體細(xì)胞經(jīng)阿霉素處理后的生存率。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R346
【圖文】：

（6）核質(zhì) RNA 提取方法同 2.2.3.3 及 2.2.3.4。2.2.3.11 pSilencer2.1-U6 puro 載體本實(shí)驗(yàn)所用的 Neative 載體為 pSilencer2.1-U6 puro 載體，具體信息見(jiàn)表及如圖 2.1。表 2.3 pSilencer 2.1-U6 Puro 干擾載體信息載體名稱: pSilencer 2.1-U6 Puro干擾載體類型 RNAi 載體啟動(dòng)子 U6、SVP40載體大小 4455bp限制性內(nèi)切酶 Hind Ш 和 BamH 篩選標(biāo)記 氨芐青霉素和嘌呤霉素

正是這些按照一定規(guī)律組分子結(jié)構(gòu)[77]。RNA 的三級(jí)構(gòu)成的，因此通過(guò)研究 生物大分子空間結(jié)構(gòu)的方傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法所檢測(cè)的大。所以借助于計(jì)算機(jī)通外公認(rèn)的主要方法。它具假結(jié)的能力及其精確度指：（1）比較序列分析方法；（5）其它相關(guān)算法[79]。NA 序列的基礎(chǔ)上，假定，配對(duì)的堿基使自由能降目前只已知了 lncRNA01A0177 的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了

碩士學(xué)位論文上圖預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出 lncRNA0177 具有與大分子相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)元環(huán)結(jié)構(gòu)，表明 lncRNA0177 可能與蛋白質(zhì)、DNA 或 RNA 發(fā)生相互作用而能。RNA 質(zhì)量檢測(cè)otal RNA 在提取之后要對(duì)其質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)量合格的 RNA 才能用下一步實(shí)驗(yàn)。rRNA 是生物體內(nèi)含量最多的 RNA，其中真核生物體內(nèi) rRNA8 S、18 S、5.8 S 和 5 S 四類，采用瓊脂糖電泳法檢測(cè) RNA 質(zhì)量時(shí)，質(zhì)量NA 能清晰的看到三條條帶，且最上面的 28 S 比中間的 18 S 亮兩倍左右、光光度計(jì)測(cè)得的 OD260:OD280 在 1.8 到 2.0 之間。Total RNA 初提后可能因組 DNA 污染，從而影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此要進(jìn)行除基因組 DNA 的主要采用 DNaseI（Fermental）酶進(jìn)行消化，去除基因組 DNA 的 RNA 也下一步純化及質(zhì)量檢測(cè)。初提和除基因組 DNA 純化后的 RNA 檢測(cè)如圖 2.4。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 寧雪蓮;劉慧;孫悅;胡建東;邱曉紅;周春水;;非編碼RNA在DNA損傷應(yīng)答與修復(fù)中的作用[J];國(guó)際遺傳學(xué)雜志;2016年05期

2 張浩文;楊禹丞;魯志;;非編碼RNA的生物信息學(xué)研究方法:RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其應(yīng)用[J];生命科學(xué);2014年03期

3 張一弛;牟艷玲;解硯英;;COX-2與糖尿病并發(fā)癥關(guān)系研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2012年01期

4 李軍,陳汝賢;博萊霉素族抗生素研究概況[J];中國(guó)新藥雜志;2003年08期

5 張宏山,陳家X,吳中亮;核苷酸切除修復(fù)與癌變[J];中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué);2002年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 邢

本文編號(hào)：2754104