【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白(GIT1和GIT2)亞家族為ARF-GAP家族成員,是含有多結(jié)構(gòu)域、在多組織中廣泛分布、具有多重功能的蛋白質(zhì)家族。GIT蛋白的兩個(gè)成員GIT1和GIT2在結(jié)構(gòu)上保守,主要包含3個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)構(gòu)域在特定的功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 GIT蛋白的N端結(jié)構(gòu)域具有小G蛋白ARF的GTP酶活化活性(GAP),被稱為ARF-GAP結(jié)構(gòu)域。GIT蛋白的中間SH (Spa homology)結(jié)構(gòu)域與鳥甘酸交換因子PIX發(fā)生相互作用,負(fù)調(diào)節(jié)小G蛋白R(shí)ac家族的活性。我們還發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域與泛素連接酶TRAF6結(jié)合,抑制TRAF6的泛素化和NF-κB信號(hào)通路的活化。GIT蛋白的C端為骨架蛋白Paxillin的結(jié)合結(jié)構(gòu)域,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。 GIT蛋白家族雖然在蛋白序列上非常保守,但是二者的組織及細(xì)胞表達(dá)譜存在很大差異。在肺臟及肝臟組織中,GIT1只表達(dá)在血管、支氣管和膽管等構(gòu)成管腔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞中,而GIT2在兩種器官中廣泛分布。此外,GIT1在神經(jīng)組織中高表達(dá),其敲除小鼠出現(xiàn)類似于注意力不足過動(dòng)癥的表型,而GIT2在免疫器官中高表達(dá),提示我們GIT2在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Git2-/-小鼠出現(xiàn)脾腫大及真菌易感性,中性粒細(xì)胞的定向遷移能力及胸腺細(xì)胞的正選擇能力減弱。我們發(fā)現(xiàn)Git2-/-小鼠自發(fā)的發(fā)生自身免疫病的癥狀,如腸道組織出現(xiàn)炎癥性腸病的病變,眼眶周圍出現(xiàn)眼瞼炎的癥狀。除此之外,Git2-/-小鼠對(duì)內(nèi)毒素LPS及大腸桿菌更為敏感,致死率更高。 炎癥性腸病是由于腸道系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致的慢性系統(tǒng)性炎癥疾病。越來越多的證據(jù)表明,炎癥腸病的發(fā)病一方面是由于免疫系統(tǒng)相關(guān)基因突變導(dǎo)致的腸道免疫系統(tǒng)對(duì)腸道微生物應(yīng)答失調(diào)導(dǎo)致的,另一方面結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖能力減弱或凋亡速率增強(qiáng)同樣會(huì)導(dǎo)致腸道系統(tǒng)的失衡引起炎癥性腸病的發(fā)生。Toll樣受體信號(hào)通路在炎癥性腸病發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,此通路的基因缺失,如Tlr4-/-及Myd88-/-小鼠均易患炎癥性腸病。我們發(fā)現(xiàn),Git2-/-小鼠更容易患硫酸葡聚糖鈉誘導(dǎo)的腸炎。GIT2在腸炎的發(fā)病過程是通過調(diào)節(jié)TLR信號(hào)通路來完成的,且造血系統(tǒng)及結(jié)腸上皮細(xì)胞中的GIT2蛋白均在腸炎的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 蛋白質(zhì)翻譯后修飾是調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要方式之一,包括泛素化、磷酸化、甲基化、乙�；刃揎�。GIT2蛋白能夠被非受體酪氨酸激酶的黏著斑激酶FAK及Src磷酸化修飾。GIT2蛋白的酪氨酸磷酸化修飾對(duì)細(xì)胞在PDGF生長(zhǎng)因子的刺激下的定向遷移能力至關(guān)重要。同樣,GIT1對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的定向遷移能力有明顯促進(jìn)作用。除了磷酸化修飾,我們發(fā)現(xiàn)GIT2蛋白上存在保守的能夠被Caspase家族切割的氨基酸序列。GIT2蛋白能夠與Caspase-7發(fā)生相互作用。Caspase-7能夠?qū)е翯IT2蛋白的切割,且Caspase-7切割GIT2的位點(diǎn)位于GIT2蛋白的N端。 Nod樣受體激活的炎癥小體信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。炎癥小體信號(hào)通路能夠抑制NK細(xì)胞及T細(xì)胞的抗腫瘤的作用,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。同時(shí),炎癥小體活化導(dǎo)致的白介素-1p及白介素-18分泌,會(huì)促進(jìn)腫瘤組織的血管生成及腫瘤細(xì)胞的侵襲。GIT1分子能夠促進(jìn)細(xì)胞的癌變,并在癌組織中持續(xù)高表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn),GIT2在直腸癌組織里表達(dá)明顯高于癌旁組織,提示我們GIT2分子可能作為一個(gè)分子靶標(biāo),用于診斷和治療直腸癌。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

分子LPS刺激后通過免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)二者的相互作用。結(jié)果表明，在LPS的刺激下，TRAF6與GIT2的相互作用增強(qiáng)（圖1 )。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)水平下GIT2能夠促進(jìn)去泛素化酶CYLD與TRAF6的結(jié)合，本研究結(jié)果表明在LPS剌激條件下，5-15分鐘后，內(nèi)源的CYLD與GIT2的結(jié)合能力同樣增強(qiáng)，同時(shí)CYLD與TRAF6的結(jié)合能力增強(qiáng)[39](圖1)。20

Myc-GIT2 _ ‘栙‘圖2: GIT2抑制TRAF6的泛素化，且依賴于去泛素化酶CYLD。圖A:轉(zhuǎn)染HA-Ub、Flag-TRAF6、Myc-GIT2到HEK293細(xì)胞中，24 h后收取細(xì)胞，檢測(cè)TRAF6的泛素化。圖 B:轉(zhuǎn)染 HA-Ub、Flag-TRAF6、Myc-GIT2 及 CYLD 的 shRNA 質(zhì)粒，48 h 后收取細(xì)胞，檢測(cè)TRAF6的泛素化。3.3 GIT2抑制TLR3/9介導(dǎo)的及IL-18活化的NF-icB信號(hào)通路NF-KB信號(hào)通路是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)最為關(guān)鍵的信號(hào)通路之一，能夠調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達(dá)。我們之前發(fā)現(xiàn)GIT2能夠抑制TLR4或IL-ip介導(dǎo)的NF-KB信號(hào)通路的活化[36，39]。同時(shí)

ODN2006 - + + +圖3: GIT2抑制TLR3/9及IL-18活化的NF-kB信號(hào)通路。圖A: GIT2抑制IL-18活化的NF-kB報(bào)告基因。HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-18R、IL-18RAP、含有NF-KB焚光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和海腎焚光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及GIT2質(zhì)粒，培養(yǎng)24h后，加入IL-18的刺激6小時(shí)，收取細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因活性。圖B: GIT2抑制Poly(I:C)活化的NF-kB24

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本文編號(hào)：2753946