【摘要】：腎移植是腎臟失能的首選治療方法,但移植排異反應(yīng)將導(dǎo)致移植腎失能,因此需終生使用免疫抑制劑。環(huán)孢霉素A(Cyclosporine A, CsA)是重要的抗移植排異反應(yīng)藥物,但CsA對腎臟具有毒性作用,是移植腎慢性失能的重要原因。腎小球內(nèi)皮細胞(Glomerular endothelial cells, GECs)損傷是移植腎慢性失能的重要機制,但藥理劑量的CsA是否可導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細胞損傷尚不清楚。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)起作用的應(yīng)激蛋白,通過其代謝產(chǎn)物CO等起抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用,可抑制宿主對移植物的排異反應(yīng)。但HO-1及其作用產(chǎn)物一氧化碳(CO)是否對腎血管內(nèi)皮細胞損傷有保護作用尚未見研究。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress ERs)是亞細胞水平的細胞內(nèi)保護機制,適度的ERs促進細胞修復(fù),重度的ERs誘導(dǎo)無法修復(fù)的細胞凋亡,但腎小球血管內(nèi)皮細胞是否存在ERs以及ERs在腎小球血管內(nèi)皮細胞生理與病理生理功能中的作用尚未見報道。 目的利用原代培養(yǎng)的腎小球內(nèi)皮細胞,觀察藥理劑量的CsA對腎小球內(nèi)皮細胞生物學特性和ERs的影響;通過誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細胞HO-1表達,或給予HO-1產(chǎn)物CO,以探討HO-1與CsA引起的腎小球內(nèi)皮細胞損傷和ERs的關(guān)系;利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP的siRNA抑制CHOP表達,探討ERs在CsA引起的腎小球內(nèi)皮細胞損傷中的作用。 方法貼壁選擇法培養(yǎng)原代大鼠腎小球內(nèi)皮細胞,CsA刺激復(fù)制腎小球內(nèi)皮細胞損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型,用化學誘導(dǎo)劑氯化高鐵血紅素(hemin)促進HO-1表達,外源性一氧化碳分子釋放劑CORM-2處理細胞模擬HO-1的作用,用針對CHOP的siRNA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用,用Western blot和RT-PCR檢測HO-1、ATF-6和CHOP表達,用annexin V和PI雙染色法、MTT降解法和細胞單層劃痕法分別檢測細胞凋亡、增殖和遷移功能。 結(jié)果 1.成功原代培養(yǎng)大鼠腎小球血管內(nèi)皮細胞所培養(yǎng)的細胞表達Ⅷ因子相關(guān)抗原,細胞單層呈現(xiàn)典型的鵝卵石樣形態(tài),不傳代培養(yǎng)1-2周后可形成管腔樣結(jié)構(gòu)。 2.CsA可損傷腎小球內(nèi)皮細胞和誘導(dǎo)ERs蛋白表達原代培養(yǎng)的腎小球內(nèi)皮細胞給予CsA(25μmol/L)刺激后細胞增殖和遷移功能明顯降低,細胞凋亡顯著增加。CsA刺激8小時后,HO-1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP的表達增加( P 0.01),對照組未給予CsA刺激,無CHOP的表達。CsA對活性和非活性狀態(tài)的CHOP上游ER蛋白ATF-6含量均無顯著影響。 3.氯化高鐵血紅素對CsA誘發(fā)的腎小球內(nèi)皮細胞損傷無保護作用HO-1的化學誘導(dǎo)劑氯化高鐵血紅素hemin(20μmol/L)刺激8小時,腎小球內(nèi)皮細胞表達HO-1蛋白和mRNA顯著增加,但其對HO-1表達的促進作用不如藥理劑量(25μmol/L)的CsA明顯。Hemin對細胞增殖、遷移、凋亡和ATF-6表達與活化均無顯著影響,但可抑制CsA誘導(dǎo)的CHOP蛋白表達量( P 0.05)。 4.一氧化碳可拮抗CsA對腎小球內(nèi)皮細胞的損傷作用與未經(jīng)任何處理的對照組相比,外源性CO釋放劑CORM-2(30μmol/L,8小時)除了可抑制腎小球內(nèi)皮細胞遷移功能外,對其它指標均無顯著影響。但CORM-2可阻斷CsA引起的細胞增殖抑制和凋亡,降低CHOP表達,對細胞遷移和ATF-6表達與活化無顯著影響。 5.CHOP可抑制CsA誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細胞凋亡 正常腎小球內(nèi)皮細胞不表達CHOP,CsA刺激后CHOP表達和細胞凋亡顯著增加,成功用針對CHOP的siRNA抑制CsA誘導(dǎo)的CHOP表達后,細胞凋亡率降至正常水平,但CHOP-siRNA對CsA的其它生物學作用無顯著影響。 結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)藥理劑量的CsA可直接抑制腎小球血管內(nèi)皮細胞生物學功能并誘導(dǎo)其凋亡,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP表達增加是CsA誘導(dǎo)該細胞凋亡的主要機制。HO-1誘導(dǎo)劑hemin對CsA引起的腎小球血管內(nèi)皮細胞損傷無保護作用,但HO-1作用產(chǎn)物CO具有顯著的保護作用,HO-1誘導(dǎo)劑本身是公認的強氧化物,對細胞有一定的毒性作用,因此CO釋放劑比HO-1誘導(dǎo)劑具有更好的藥理學應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn)的CsA腎毒性的新機制和潛在治療藥物對減輕腎移植排異反應(yīng)治療中的副作用具有一定的指導(dǎo)作用。
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R363
【圖文】：

原代分離得到的腎小球，無腎小管，腎小球包囊去除，血管袢松解500μm100μm

腎小球內(nèi)皮細胞圍繞腎小球克隆性生長，B.去除腎小球后的腎小球內(nèi)皮細胞

細胞傳代后，內(nèi)皮細胞體積中等，為扁平的多邊形、大小均勻，形態(tài)似鋪路石樣

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本文編號：2752909