本文關(guān)鍵詞：REGγ選擇性介導(dǎo)降解氧化損傷HCV Core蛋白和p21及其機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：當(dāng)細(xì)胞受到體外或者體內(nèi)的氧化物質(zhì)刺激時,會產(chǎn)生一系列變化,并生成活性氧(ROS)�；钚匝跏菣C(jī)體正常代謝的副產(chǎn)物,當(dāng)其產(chǎn)生過量時便會對細(xì)胞造成損傷,包括損傷蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞膜等。一定程度的氧化損傷累積可以誘發(fā)相關(guān)疾病,如：動脈粥樣硬化、肺纖維化、癌癥、神經(jīng)退行性疾病和衰老等等。研究表明,蛋白質(zhì)是細(xì)胞氧化損傷最直接的作用對象,它與氧化自由基作用的幾率大約是核酸的20倍。因此細(xì)胞內(nèi)的抗氧化機(jī)制,很大程度上是發(fā)生在蛋白水平的。細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化損傷機(jī)制應(yīng)該是從清除過量的氧化損傷蛋白質(zhì)著手。而據(jù)文獻(xiàn)報道,20S蛋白酶體在降解氧化損傷蛋白質(zhì)過程中起到了十分重要的作用。種11S蛋白酶體調(diào)節(jié)因子(REGy/PA28y)被報導(dǎo)參與調(diào)節(jié)20S蛋白酶體以一種非泛素和ATP依賴的方式降解蛋白質(zhì)。我們的研究發(fā)現(xiàn),一定濃度的H2O2處理HeLa細(xì)胞時,p21的蛋白質(zhì)水平會迅速降低,而其mRNA水平卻基本沒有變化。而在穩(wěn)定敲除REGy的HeLa細(xì)胞系中,氧化處理之后,p21的蛋白水平幾乎沒有變化。用不同濃度及不同種類的氧化劑處理也可以得到類似的結(jié)果,這說明REGy在氧化的p21蛋白質(zhì)降解過程中起著十分重要的作用。因此,本文對REGy這種介導(dǎo)氧化蛋白降解的作用進(jìn)行了進(jìn)一步的研究和探索,通過對REGy介導(dǎo)降解的另一種目的蛋白——丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)進(jìn)行氧化處理研究,也發(fā)現(xiàn)了同樣的趨勢。本文構(gòu)建了HCV core的表達(dá)載體質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入穩(wěn)定敲除REGy以及不敲除(對照組)的HeLa細(xì)胞系中表達(dá),經(jīng)過氧化處理后,發(fā)現(xiàn)其降解趨勢和p21一致。此外,在一組REGy無功能和正常功能的細(xì)胞系中,REGy正常功能的細(xì)胞中HCV core經(jīng)氧化應(yīng)激后也表現(xiàn)出了REGy依賴降解的現(xiàn)象,而氧化應(yīng)激對REGy無功能細(xì)胞中HCV core的表達(dá)幾乎無影響。這些現(xiàn)象說明,REGγ在氧化損傷蛋白的清除過程中十分重要。本文通過體外降解、免疫共沉淀和胰蛋白酶樣活性檢測實(shí)驗(yàn)還證明：氧化應(yīng)激在一定程度上增強(qiáng)20S蛋白酶體的胰蛋白酶樣活性,并加強(qiáng)了REGγ與20S蛋白酶體的相互結(jié)合。另一方面,通過對細(xì)胞衰老凋亡標(biāo)志蛋白的表達(dá)檢測和細(xì)胞形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn),也證實(shí)了氧化蛋白p21和HCV core的降解現(xiàn)象與細(xì)胞氧化引起的衰老和凋亡沒有直接關(guān)系。這些結(jié)果以新視角補(bǔ)充了REGy對氧化損傷蛋白的調(diào)控機(jī)制。盡管我們對于氧化蛋白的清除機(jī)制并不十分清楚,還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。但是,本文的研究方式和結(jié)果為氧化蛋白的降解提供了一條新的通路,也為氧化相關(guān)疾病的研究提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：REGγ 蛋白酶體 p21 HCV core 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 1、綜述12-25
• 1.1 REG_γ的發(fā)現(xiàn)與研究12-15
• 1.1.1 REG_γ的發(fā)現(xiàn)及其家族成員12
• 1.1.2 REG_γ及其家族的結(jié)構(gòu)特性12-14
• 1.1.3 REG_γ及其家族的生物學(xué)活性14
• 1.1.4 REG_γ及其家族的功能14-15
• 1.2 蛋白酶體降解系統(tǒng)研究15-18
• 1.2.1 蛋白酶體結(jié)構(gòu)分析15-16
• 1.2.2 蛋白酶體功能16-18
• 1.3 氧化損傷蛋白降解體系18-24
• 1.3.1 氧化應(yīng)激反應(yīng)18-19
• 1.3.2 氧化損傷引起的疾病19-20
• 1.3.3 氧化損傷蛋白降解20-24
• 1.4 研究目的與意義24-25
• 2. 材料與方法25-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞25
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)用試劑和材料25-27
• 2.1.3 設(shè)備儀器27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-44
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)過程(復(fù)蘇、傳代、凍存)28-29
• 2.2.2 蛋白免疫印跡(Western Blot)29-32
• 2.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建32-37
• 2.2.4 病毒包裝37
• 2.2.5 免疫共沉淀(co-IP)37-38
• 2.2.6 提取、鑒定基因組38-39
• 2.2.7 RNA提取(細(xì)胞中提取)39
• 2.2.8 反轉(zhuǎn)39-40
• 2.2.9 QPCR(熒光定量PCR)40-41
• 2.2.10 半定量PCR41-42
• 2.2.11 體外降解實(shí)驗(yàn)42
• 2.2.12 蛋白酶體Trypsin-like活性檢測42-44
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析44-67
• 3.1 氧化應(yīng)激下REG_γ對p21依賴20S蛋白酶體降解的調(diào)控44-50
• 3.1.1 氧化處理下p21蛋白水平和mRNA水平的變化44-45
• 3.1.2 氧化處理下的其他細(xì)胞中p21的蛋白水平變化45-47
• 3.1.3 抗氧化劑對p21氧化降解的調(diào)節(jié)作用47-49
• 3.1.4 體外翻譯表達(dá)的p21在氧化應(yīng)激下的降解情況49-50
• 3.2 氧化應(yīng)激下REG_γ對HCV core蛋白依賴20S蛋白酶體降解的調(diào)控50-59
• 3.2.1 HCV core蛋白表達(dá)載體的質(zhì)粒構(gòu)建和表達(dá)50-54
• 3.2.2 HCV core在氧化應(yīng)激下蛋白的變化54-57
• 3.2.3 不同的氧化劑處理下HCV core的蛋白水平變化57-59
• 3.3 關(guān)于氧化損傷蛋白依賴REG_γ調(diào)控被降解的機(jī)制59-63
• 3.3.1 氧化應(yīng)激促進(jìn)REG_γ對20S蛋白酶體胰蛋白酶樣(Trypsin-Like)活性的調(diào)控增強(qiáng)60-61
• 3.3.2 氧化應(yīng)激會促進(jìn)REG_γ和20S蛋白酶體的結(jié)合61-63
• 3.4 評估氧化對細(xì)胞的毒性效應(yīng)63-67
• 3.4.1 氧化應(yīng)激對細(xì)胞凋亡的影響63-65
• 3.4.2 氧化應(yīng)激對細(xì)胞形態(tài)的影響65-67
• 4. 討論與展望67-71
• 附錄71-76
• 參考文獻(xiàn)76-87
• 致謝87

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