【摘要】：目的:1)國內(nèi)外既往的研究,對(duì)于依托c AMP、c GMP等細(xì)胞內(nèi)信使相關(guān)的腸黏膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的分子生物學(xué)機(jī)制已經(jīng)相當(dāng)清楚,但對(duì)于是否存在單獨(dú)依賴于胞內(nèi)鈣信號(hào)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控及其分子機(jī)制,知之甚少。本課題通過研究小腸上皮細(xì)胞,單獨(dú)依賴于鈣信號(hào)調(diào)控的氯離子及碳酸氫鹽分泌及其機(jī)制,以開創(chuàng)胞內(nèi)鈣信號(hào)調(diào)控腸黏膜上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)研究的新領(lǐng)域;2)眾所周知,氯離子的分泌與腸道內(nèi)水平衡及腹瀉、便秘密切相關(guān);而腸道碳酸氫鹽的分泌在腸黏膜保護(hù)及機(jī)體酸堿平衡中起到重要的作用。通過針對(duì)鈣信號(hào)介導(dǎo)的腸黏膜上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究,既能揭示新穎的腸道內(nèi)水平衡調(diào)節(jié)和腸黏膜屏障的保護(hù)作用,又能為治療潰瘍、炎癥性腸病(IBD)、腹瀉、便秘等疾病的防治提供新的思路;方法:Ussing Chamber(多通道電流電壓鉗)是研究跨上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)的重要技術(shù),可用于包括離子轉(zhuǎn)運(yùn)、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)等的研究。我們?nèi)⌒∈笫改c上皮,用Ussing Chamber儀器檢測加入上皮頂端膜側(cè)和基底膜側(cè)改變胞內(nèi)鈣信號(hào)的不同工具藥物后,由于氯離子和碳酸氫根離子分泌產(chǎn)生的短路電流(Isc)變化,反應(yīng)十二指腸上皮細(xì)胞不同極性相關(guān)通道蛋白的生物學(xué)功能情況以及鈣信號(hào)對(duì)腸黏膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果:咖啡因激活小鼠十二指腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的RyR受體,通過鈣信號(hào)導(dǎo)致短路電流的增加。而增加的短路電流強(qiáng)度可以被上皮細(xì)胞基底膜側(cè),而非頂側(cè)端的無鈣環(huán)境和選擇性鈣庫操作性鈣離子通道(store-operated calcium channel,SOC)抑制劑所明顯抑制。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在十二指腸基底膜側(cè),CRAC/Orai通道在介導(dǎo)細(xì)胞外鈣內(nèi)流的過程中起著重要的作用�？Х纫蚣せ頡yR受體后導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的增加,和介導(dǎo)上述通道導(dǎo)致細(xì)胞外鈣內(nèi)流后形成的鈣信號(hào),共同作用導(dǎo)致十二指腸上皮細(xì)胞頂端膜側(cè)的Ca CCs(鈣激活的氯離子通道)和AE(陰離子交換蛋白)激活,其產(chǎn)生的短路電流強(qiáng)度均可被Ca CCs和AE的抑制劑所抑制;另外,我們發(fā)現(xiàn)用c AMP通路的激動(dòng)劑Forskolin和咖啡因共同添加可以增強(qiáng)短路電流,而兩者前后分別添加產(chǎn)生的增強(qiáng)電流作用有所區(qū)別。先添加Forskolin可以增強(qiáng)咖啡因產(chǎn)生的短路電流,但先添加咖啡因卻不能增強(qiáng)Forskolin產(chǎn)生的短路電流。結(jié)論:咖啡因作用于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RyR受體使內(nèi)鈣釋放及CRAC/Orai通道介導(dǎo)的鈣庫操作性鈣離子內(nèi)流,共同導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子濃度增加,產(chǎn)生的鈣信號(hào)在十二指腸上皮細(xì)胞離子分泌過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。上述鈣信號(hào)作用于細(xì)胞頂端膜側(cè)的Ca CCs(鈣激活的氯離子通道)和AE(陰離子交換蛋白),達(dá)到單獨(dú)調(diào)節(jié)氯離子和碳酸氫根分泌的作用。而經(jīng)典的c AMP通路可以與上述鈣信號(hào)產(chǎn)生協(xié)同作用促進(jìn)上皮細(xì)胞的離子分泌。我們的研究為保護(hù)上消化道黏膜及維持小腸的水電解質(zhì)平衡提供了新的藥物作用靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R333
【圖文】：

RyR受體抑制劑作用后的Isc變化

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 何佳A 圖示 RyR 受體的阻斷劑 Ruth red 加入后的 Isc 變化；B 圖示 RyR 受體的阻斷劑 Dan 分別加入頂端膜和基底膜側(cè)（s）的 Isc 變化。進(jìn)一步需要確定細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放是否可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外鈣內(nèi)流進(jìn)入上皮細(xì)胞；繼續(xù)應(yīng)用 Ussing Chamber 試驗(yàn)，比較在基底膜側(cè)細(xì)胞外液是否有鈣的情況下，因激動(dòng)導(dǎo)致的短路電流的變化。如圖 2 所示，當(dāng)基底膜側(cè)細(xì)胞外液無鈣時(shí)，用咖激動(dòng)導(dǎo)致的短路電流跟基底膜側(cè)細(xì)胞外有鈣的情況比較，電流有明顯的減弱（P<0而當(dāng)頂端膜側(cè)無鈣和頂端膜及基底膜側(cè)同時(shí)無鈣的情況下，電流的衰減并不明顯

圖 3 SOCE 抑制劑作用后的 Isc 變化。A 圖示 SOCE 抑制劑 2-APB 分別加入頂端膜側(cè)（m）和基底膜側(cè)（s）的 Isc 變化；B 圖示 SOCE 抑制劑別加入頂端膜側(cè)（m）和基底膜側(cè)（s）的 Isc 變化;C 圖示 SOCE 抑制劑 FFA 分別加入頂端膜側(cè)（m）和基底膜的 Isc 變化。綜上所述，咖啡因結(jié)合 RyR 受體引起細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的增加，鈣庫耗竭后，在十二指腸上皮細(xì)胞的基底膜側(cè)促進(jìn)外鈣內(nèi)流的過程中發(fā)揮了重要的作用。2.3 CRAC/Orai 通道在咖啡因刺激腸道分泌中的調(diào)節(jié)作用。前面的實(shí)驗(yàn)過程中，我們篩選了 SOCE 在十二指腸上皮細(xì)胞分泌中的作用。們進(jìn)一步篩選與 SOCE 相關(guān)的分子機(jī)制前，我們還篩選了是否有其他的介導(dǎo)外鈣的通道參與了咖啡因與 RyR 受體結(jié)合后產(chǎn)生的鈣信號(hào)的生理學(xué)效應(yīng)，我們選擇了的位于基底膜側(cè)的促進(jìn)外鈣內(nèi)流的通道，例如：TRPV1，TRPV4 和 NCX，分別選

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