【摘要】：背景與目的:耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是地球上已知的耐受電離輻射最強的生物之一,能夠高度耐受電離輻射、紫外線、H2O2、干燥以及其他DNA理化損傷劑的損傷。pprM基因是DR中功能未知的獨特基因,生物信息學分析發(fā)現(xiàn)PprM擁有CSD結構域(“Cold-shock”DNA-binding domain),推測其可能是一種DNA結合蛋白,能夠與靶DNA結合而發(fā)揮相應的生物學效應。本研究擬應用目前在體內(nèi)研究蛋白質-DNA相互作用的最佳的方法染色質免疫沉淀技術(ChIP)來篩選PprM蛋白相互作用的靶DNA,探索PprM與它們的調(diào)控關系。方法:本研究通過設計并合成能夠擴增HA-pprM基因全長的引物,以無突變的pGEX-6p-1-pprM載體為模版,PCR擴增出攜帶NdeⅠ酶切位點的HA-pprM基因全長,大小約438bp,經(jīng)NdeⅠ酶切后,與pRADK載體連接后轉化大腸桿菌,經(jīng)培養(yǎng)、質粒提取純化后,以瓊脂糖凝膠電泳、酶切鑒定以及基因測序確認插入序列的正確性;將構建好的重組質粒pRADK-HA-pprM,以改良的CaC12法轉化到耐輻射奇球菌pprM基因缺失菌株中,以表達HA-PprM融合蛋白,并用Western blot驗證HA-PprM融合蛋白的表達。然后使用HA-tag抗體順利實施染色質免疫沉淀技術(ChIP)獲得與PprM蛋白質具有相互作用的DNA混合液,分別設計4個關鍵基因的啟動子區(qū)域的PCR引物,ChIP PCR的方法檢測DNA混合液相應的啟動子區(qū)域的結合情況。結果:成功構建pRADK-HA-pprM穿梭表達載體,經(jīng)測序分析,序列無任何突變;成功轉化到耐輻射奇球菌pprM基因缺失菌株中,并通過Western blot驗證回補株中能夠表達HA-PprM融合蛋白;染色質免疫沉淀(ChIP)與ChIP PCR實驗結果顯示成功篩選到3個與PprM蛋白具有相互作用的靶DNA,分別是pprI、pprA、recA的啟動子。結論:1.成功構建了pRADK-HA-pprM穿梭表達載體,并獲得耐輻射奇球菌pprM基因缺失回補菌株;2.應用ChIP PCR技術發(fā)現(xiàn)2 kGy輻照及未輻照條件下耐輻射奇球菌Ppr M蛋白均不與自身基因啟動子結合;未輻照條件下PprM蛋白不與pprI、recA基因啟動子結合而與pprA基因啟動子結合;2 kGy輻照條件下PprM蛋白與pprI、recA、pprA三基因啟動子均結合,且與pprA基因啟動子結合能力增強。提示PprM蛋白可能作為一種輻射應激轉錄因子調(diào)控耐輻射奇球菌抗輻射調(diào)控網(wǎng)絡重要元件pprI、recA、pprA基因的表達。
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378

【引證文獻】

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1 潘寶平;馬云;何淑雅;;環(huán)境應激蛋白PprM研究進展[J];中南醫(yī)學科學雜志;2017年01期

本文編號：2746591