【摘要】：目的:(1)通過無血清培養(yǎng)技術(shù)從GFP+-小鼠胚胎脊髓分離和培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞(NSC),采用免疫熒光技術(shù)鑒定NSC。(2)建立小鼠脊髓損傷模型,向脊髓損傷處附近注射GFP+-神經(jīng)干細(xì)胞,觀察小鼠運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況和GFP+-神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的成活、分化情況,揭示神經(jīng)干細(xì)胞在臨床中治療脊髓損傷的作用。方法:(1)GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖;(2)通過從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的胎鼠體內(nèi)獲得脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞,體外分離培養(yǎng)并鑒定;(3)將小鼠隨機(jī)分為空白組(30只),損傷組(30只)與細(xì)胞移植組(30只),采用Impactor M-III脊髓撞擊器,對小鼠暴露的脊髓進(jìn)行擊打建立小鼠脊髓損傷模型。細(xì)胞移植組在擊打后向損傷處注入5μL神經(jīng)干細(xì)胞懸液;損傷組僅僅只擊打脊髓;空白組不做任何處理;(4)在1 w、2 w、4 w、6 w和8 w不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行行為學(xué)觀察,記錄小鼠的BBB運(yùn)動(dòng)功能評分和斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果;同時(shí)也在1 w、2 w、4 w、6 w和8 w時(shí),每組分別處死6只小鼠,3只用于免疫組織化學(xué)檢測和尼氏(Nissl)染色,另3只通過熒光定量PCR技術(shù)檢測Nestin、ChAT和GFAP基因表達(dá)量的變化情況,觀察NSC在小鼠脊髓損傷模型內(nèi)的成活、分化狀態(tài)及損傷脊髓的修復(fù)情況。結(jié)果:體外成功培養(yǎng)出了神經(jīng)干細(xì)胞,將傳至第三代的神經(jīng)干細(xì)胞接種到載玻片,熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈規(guī)則的圓形,折光性強(qiáng),界限清晰,神經(jīng)球發(fā)出很強(qiáng)的綠色熒光。免疫熒光法檢測,Nestin表達(dá)呈陽性。采用Impactor M-III脊髓撞擊器,對小鼠暴露的脊髓進(jìn)行擊打建立小鼠脊髓損傷模型。擊打后小鼠雙后肢均癱瘓,BBB評分為0,移植2 w后移植組較損傷組BBB評分有顯著差異(P0.05),4 w移植組較損傷組斜板傾斜角度有明顯差異(P0.05)。熒光顯示移植的NSCs會(huì)在體內(nèi)存活并遷移,部分保持未分化狀態(tài),少部分分化為膠質(zhì)細(xì)胞,向神經(jīng)元分化較少。PCR結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致,Nestin顯示在注射初期,移植組的Nestin的表達(dá)量明顯高于損傷組,2 w后差距開始減少,并在6 w后與空白組表達(dá)接近;移植組與損傷組的ChAT的表達(dá)在損傷初期均減少,2 w時(shí)開始增多,移植組的增長明顯高于損傷組;兩組GFAP的表達(dá)在損傷后表達(dá)持續(xù)升高,但移植組GFAP的表達(dá)低于損傷組。Nissl染色結(jié)果顯示損傷1 w~2 w時(shí),移植組與損傷組的尼氏小體數(shù)量均持續(xù)減少;但4 w后開始出現(xiàn)新的尼氏小體,而且移植組的尼氏小體數(shù)量比損傷組的數(shù)量多。結(jié)論:(1)體外移植的神經(jīng)干細(xì)胞可以在體內(nèi)存活、分化。(2)NSCs對脊髓損傷的恢復(fù)有促進(jìn)作用,這種作用是通過移植細(xì)胞后形成一個(gè)有利于恢復(fù)的微環(huán)境,增加向神經(jīng)元分化的比例來促進(jìn)恢復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R651.2;R-332

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本文編號(hào)：2746305