【摘要】：目的用細胞膜綠色熒光探針Di O標記人骨髓間充質(zhì)干細胞(h BMMSCs),探討其對h BMMSCs生物學(xué)功能的影響。方法采用Ficoll密度梯度離心法分離、培養(yǎng)h BMMSCs;流式細胞術(shù)檢測Di O對h BMMSCs的標記效率;通過Transwell遷移實驗、平板克隆實驗、生長曲線分析、成脂及成骨誘導(dǎo)實驗分別檢測Di O對h BMMSCs遷移、增殖和多向分化能力的影響。結(jié)果Di O對h BMMSC的標記效率可達(99.5±0.4)%;Transwell遷移實驗、平板克隆實驗、生長曲線分析、成脂及成骨誘導(dǎo)實驗結(jié)果表明,與未標記h BMMSCs相比,標記后的h BMMSCs遷移、增殖及成脂、成骨分化能力未見明顯改變,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。結(jié)論經(jīng)Di O處理未見明顯影響h BMMSCs的生物學(xué)功能,可做為安全、有效的h BMMSCs體外標記綠色熒光染料。
【圖文】：

注:A，未標記hBMMSCs白光圖;B，DiO標記的hBMMSCs白光圖;C，DiO標記的hBMMSCs熒光圖。圖1DiO標記后hBMMSCs熒光圖(×100)2．2hBMMSCs的標記效率熒光顯微鏡下可觀察到經(jīng)DiO標記24h后的hBMMSCs呈現(xiàn)綠色熒光，見圖1。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，標記DiO的hBMMSCs陽性率可達到(99．5±0．4)%，未標記的hBMMSCs陽性率僅為(0．5±0．4)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=568．4，P＜0．05)。2．3DiO標記對hBMMSCs遷移能力的影響Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，DiO標記的hBMMSCs遷移數(shù)目約為(88．0±3．1)個，與未標記hBMMSCs(87．3±1．5)個相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0．05，P＞0．05)。2．4DiO標記對hBMMSCs增殖能力的影響克隆形成試驗結(jié)果顯示，2周后DiO標記的hBMMSCs形成的克隆數(shù)目約為(203．7±17．9)個，與未標記hBMMSCs(196．7±12．0)個相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0．32，P＞0．05)。細胞增殖實驗顯示，DiO標記后hBMMSCs與未標記hBMMSCs的生長曲線變化基本一致，(F=0．005，P＞0．05)，見圖2。圖2DiO標記后hBMMSCs生長曲線2．5DiO標記對hBMMSCs分化能力的影響分別對DiO標記與未標記的hBMMSCs進行成脂和成骨誘導(dǎo)，成脂誘導(dǎo)6d后兩組細胞在光學(xué)顯微鏡下均可觀察到折光性很強的小空泡出現(xiàn)，提示脂滴形成，誘導(dǎo)2周后，細胞用油紅O染色，兩組細胞胞漿中均可見大量桔紅色的小脂滴(圖3A)。細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)3周后，用茜素紅染色，光鏡下可看見大量陽性的胞質(zhì)染成紅棕色的多邊形細胞(圖3B)。表明DiO標記對hBMMSCs向成脂細胞和成骨細胞分化的能力無明顯影響。注:A，油紅O染色;B，茜素紅S染色。圖3DiO標記后hBMMSCs成脂誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)(×100)·54·臨床檢驗雜志2016年1月第34卷第1期ChinJClinLabSci，Jan．2016，Vol．34，No．1

注:A，未標記hBMMSCs白光圖;B，DiO標記的hBMMSCs白光圖;C，DiO標記的hBMMSCs熒光圖。圖1DiO標記后hBMMSCs熒光圖(×100)2．2hBMMSCs的標記效率熒光顯微鏡下可觀察到經(jīng)DiO標記24h后的hBMMSCs呈現(xiàn)綠色熒光，見圖1。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，標記DiO的hBMMSCs陽性率可達到(99．5±0．4)%，未標記的hBMMSCs陽性率僅為(0．5±0．4)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=568．4，P＜0．05)。2．3DiO標記對hBMMSCs遷移能力的影響Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，DiO標記的hBMMSCs遷移數(shù)目約為(88．0±3．1)個，與未標記hBMMSCs(87．3±1．5)個相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0．05，P＞0．05)。2．4DiO標記對hBMMSCs增殖能力的影響克隆形成試驗結(jié)果顯示，2周后DiO標記的hBMMSCs形成的克隆數(shù)目約為(203．7±17．9)個，與未標記hBMMSCs(196．7±12．0)個相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0．32，P＞0．05)。細胞增殖實驗顯示，DiO標記后hBMMSCs與未標記hBMMSCs的生長曲線變化基本一致，(F=0．005，P＞0．05)，見圖2。圖2DiO標記后hBMMSCs生長曲線2．5DiO標記對hBMMSCs分化能力的影響分別對DiO標記與未標記的hBMMSCs進行成脂和成骨誘導(dǎo)，成脂誘導(dǎo)6d后兩組細胞在光學(xué)顯微鏡下均可觀察到折光性很強的小空泡出現(xiàn)，提示脂滴形成，誘導(dǎo)2周后，細胞用油紅O染色，兩組細胞胞漿中均可見大量桔紅色的小脂滴(圖3A)。細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)3周后，用茜素紅染色，光鏡下可看見大量陽性的胞質(zhì)染成紅棕色的多邊形細胞(圖3B)。表明DiO標記對hBMMSCs向成脂細胞和成骨細胞分化的能力無明顯影響。注:A，油紅O染色;B，茜素紅S染色。圖3DiO標記后hBMMSCs成脂誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)(×100)·54·臨床檢驗雜志2016年1月第34卷第1期ChinJClinLabSci，Jan．2016，Vol．34，No．1

注:A，未標記hBMMSCs白光圖;B，DiO標記的hBMMSCs白光圖;C，DiO標記的hBMMSCs熒光圖。圖1DiO標記后hBMMSCs熒光圖(×100)2．2hBMMSCs的標記效率熒光顯微鏡下可觀察到經(jīng)DiO標記24h后的hBMMSCs呈現(xiàn)綠色熒光，見圖1。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，標記DiO的hBMMSCs陽性率可達到(99．5±0．4)%，未標記的hBMMSCs陽性率僅為(0．5±0．4)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=568．4，P＜0．05)。2．3DiO標記對hBMMSCs遷移能力的影響Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，DiO標記的hBMMSCs遷移數(shù)目約為(88．0±3．1)個，與未標記hBMMSCs(87．3±1．5)個相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0．05，P＞0．05)。2．4DiO標記對hBMMSCs增殖能力的影響克隆形成試驗結(jié)果顯示，2周后DiO標記的hBMMSCs形成的克隆數(shù)目約為(203．7±17．9)個，與未標記hBMMSCs(196．7±12．0)個相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0．32，P＞0．05)。細胞增殖實驗顯示，DiO標記后hBMMSCs與未標記hBMMSCs的生長曲線變化基本一致，(F=0．005，P＞0．05)，見圖2。圖2DiO標記后hBMMSCs生長曲線2．5DiO標記對hBMMSCs分化能力的影響分別對DiO標記與未標記的hBMMSCs進行成脂和成骨誘導(dǎo)，成脂誘導(dǎo)6d后兩組細胞在光學(xué)顯微鏡下均可觀察到折光性很強的小空泡出現(xiàn)，提示脂滴形成，誘導(dǎo)2周后，細胞用油紅O染色，兩組細胞胞漿中均可見大量桔紅色的小脂滴(圖3A)。細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)3周后，用茜素紅染色，光鏡下可看見大量陽性的胞質(zhì)染成紅棕色的多邊形細胞(圖3B)。表明DiO標記對hBMMSCs向成脂細胞和成骨細胞分化的能力無明顯影響。注:A，油紅O染色;B，茜素紅S染色。圖3DiO標記后hBMMSCs成脂誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)(×100)·54·臨床檢驗雜志2016年1月第34卷第1期ChinJClinLabSci，Jan．2016，Vol．34，No．1

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