【摘要】：柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16, CVA16)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus),是手足口病(Hand-foot-and-mouth Disease, HFMD)的主要致病原之一,常與另一重要病原體腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV-A71)交替或共同流行。CVA16多引起兒童的HFMD,皰疹性咽峽炎等自限性疾病,但亦可引起患者出現(xiàn)心肌炎、心包炎、無菌性腦膜炎、腦干腦炎和肺炎等重癥并發(fā)癥,甚至可導(dǎo)致死亡。CVA16在我國多個地區(qū)引起過暴發(fā)流行,成為重要的公共衛(wèi)生問題。目前尚無控制CVA16感染的有效藥物及手段。隨著EV-A71疫苗的即將上市,CVA16所引發(fā)的HFMD等疾病的流行將更加引起大家的重視。目前國內(nèi)外多家研究機構(gòu)致力于CVA16疫苗的研究,取得了很大的進(jìn)展,但至今仍未開發(fā)出具有醫(yī)藥應(yīng)用價值的疫苗。目前研究的疫苗形式包括全病毒滅活疫苗、病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)疫苗、重組VP1亞單位疫苗、DNA疫苗等類型。病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)疫苗由于形態(tài)上與天然病毒粒子相似、具有更全的抗原表位、不含感染性的核酸、安全性更高,是一種更具開發(fā)潛力的新型疫苗類型。CVA16 VLPs疫苗雖然之前有過報道,但缺乏更深入的研究,如不同免疫途徑對免疫效果的影響,夠疫產(chǎn)生的特異性抗體的變化規(guī)律,及對機體產(chǎn)生保護(hù)作用的具體指標(biāo)均沒有詳細(xì)的報道。因此,研究我國CVA16流行株基因特征,評估CVA16 VLPs疫苗的免疫保護(hù)性,對我國CVA16疫苗的研發(fā)兒有重要的參考價值。本研究通過對我國CVA16代表株的全基因序列的測定,闡明我國CVA16的分子流行病學(xué)情況及其全基因組特征。鑒定篩選了CVA16疫苗候選株,應(yīng)用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備了較高純度的CVA16 VLPs。并應(yīng)用滅活CVA16及重組衣殼蛋白VP1做免疫比較,利用ICR小鼠模型評價該疫苗刺激產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫效果,并對該疫苗的保護(hù)性進(jìn)行了評估 通過對新生乳鼠攻毒后組織器官的病理學(xué)、免疫組化及病毒載量的檢測,進(jìn)一步分析了病毒侵入機體后增殖的動態(tài)變化過程及對各個組織器官造成的損傷,更為深入的闡釋了對候選疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)作用進(jìn)行全面評估的價值及意義。結(jié)果表明,該VLPs疫苗對小鼠具有良好的免疫保護(hù)效果,能有效阻止病毒對機體的侵襲及增殖,是極具開發(fā)前景的疫苗形式。本研究工作主要包括3個部分。第一部分：我國CVA16代表株基因組基因特征分析我們挑選具有代表性的CVA16陽性株,應(yīng)用特異性引物對其全基因組進(jìn)行擴增,并進(jìn)行核苷酸序列測定。將VPl序列及全基因組序列分別與GenBank中CVA16序列進(jìn)行比對,并應(yīng)用Bio Edit、MEGA及Sim plot軟件進(jìn)行種系進(jìn)化分析、基因組特征及重組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國現(xiàn)在流行的CVA16均為B1亞型中的B1a和B1b進(jìn)化支,一直沒有B1c進(jìn)化支的報道；且中國大陸CVA16的流行亞型也未發(fā)現(xiàn)有明顯的地域性差異,不同地區(qū)流行的毒株在親緣關(guān)系樹上無明顯的分簇。全基因組研究發(fā)現(xiàn),中國流行的CVA16是多種A組腸道病毒的多重重組病毒,重組主要發(fā)生在5'UTR及非結(jié)構(gòu)蛋白P2、P3編碼區(qū)。CVA16 B1a及B1b進(jìn)化支在傳播流行過程中,比較穩(wěn)定；亞型內(nèi)及亞型間均具有較高的核苷酸及氨基酸同源性。推測中國所有流行株可能為同一祖先獨立進(jìn)化而來。CVA16這種緩慢的進(jìn)化及變異成為疫苗開發(fā)的一個有利條件。第二部分：CVA16 VLPs疫苗的制備及鑒定根據(jù)本研究中分子流行病學(xué)研究結(jié)果及流行現(xiàn)狀,我們選取CVA16 B1b亞型毒株521-01T作為CVA16疫苗研制的候選株。對病毒P1及3CD蛋白的全長編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后克隆入同一桿狀病毒穿梭質(zhì)粒pFastBac-Dual中,Pl及3CD分別由啟動子PPH及Pp10控制。進(jìn)一進(jìn)對質(zhì)粒啟動子進(jìn)行改造,將控制3CD的P10啟動子改為啟動效率稍你的('MV啟動子。分別構(gòu)建出重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒Bacmid-P1-3CD及Bacmid-C-P1-3CD轉(zhuǎn)染Sf9蟲細(xì)胞獲得表達(dá)P1和3CD的重組桿狀病毒(AcMNPV-P1-3CD)及AcMNPV-C-P1-3CD).使用IFA、Western-blot及電鏡對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和分析 通過優(yōu)化MOI仇及表達(dá)時間,并應(yīng)用懸浮培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞進(jìn)行VLPs的大量表達(dá)；層析及密度梯度離心法純化VLPs顆粒。同時,應(yīng)用VERO細(xì)胞培養(yǎng)并獲得純化的滅活CVA16全病毒,并應(yīng)用原核表達(dá)體系,獲得純化并復(fù)性的病毒衣殼蛋白VP1,分別進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,表達(dá)的P1蛋白前體被3CD蛋白酶切割為衣殼蛋白VP0、VP1及VP3并自主裝配成了CVA16 VLPs,且該VLPs結(jié)構(gòu)完整,大小位于25-30nm之間,與完整病毒顆粒一致。且啟動子改造后能明顯提高VLPs的表達(dá)量。通過超速離心純化獲得了高純度的CVA16 VLPs。并獲得純化的CVA16滅活病毒及充足VP1蛋白。第三部分：CVA16 VLPs疫苗的免疫學(xué)特性研究選用6周齡雌性ICR小鼠為實驗動物模型評估三種抗原免疫效果。優(yōu)化免疫劑量,并將三種抗原分別配伍Al(OH)3佐劑及CpG佐劑以肌肉注射的方式,配伍CpG佐劑以滴鼻免疫的方式在第0天、14天和28天進(jìn)行三次免疫。通過檢測CVA16特異性抗體、中和抗體滴度和T細(xì)胞免疫反應(yīng)來探討抗原刺激機體所產(chǎn)生的細(xì)胞和體液免疫效果,并通過對免疫后小鼠配種所產(chǎn)乳鼠病毒攻擊實驗來評價三種疫苗對小鼠產(chǎn)生的被動保護(hù)作用。并對實驗乳鼠的組織器官進(jìn)行HE染色、免疫組化等實驗分析,獲得病理損傷和病原學(xué)變化資料,從而揭示疫苗對小鼠產(chǎn)生的保護(hù)作用機制。結(jié)果顯示,注射免疫途徑：CVA16 VLPs和滅活CVA16全病毒組均能刺激機體產(chǎn)生高水平的特異性抗體(血清IgG抗體均可達(dá)1:2×105)。VLPs誘導(dǎo)抗體中和活性與滅活CVA16相當(dāng),均可達(dá)到1：512。T細(xì)胞免疫檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),CVA16 VLPs可刺激小鼠機體產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫反應(yīng),機體產(chǎn)生的特異性IFN-γ分泌T淋巴細(xì)胞數(shù)目與滅活CVA16全病毒組的相當(dāng)(P0.05),可以推測CVA16 VLPs免疫小鼠能同時誘導(dǎo)機體Th1和Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)。黏膜免疫途徑：滅活CVA16全病毒組無論在體液免疫還是細(xì)胞免疫效果方面均略優(yōu)于CVA16 VLPs組(P0.05)。且sIgA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),除呼吸道中二者sIgA滴度均可達(dá)210以上(P0.05), CVA16全病毒組在腸道及陰道灌洗液中sIgA滴度要高于CVA16 VLPs組。而VP1免疫組雖然可以誘導(dǎo)高滴度的IgG抗體,但該抗體中和效價均低于1:8,且細(xì)胞免疫水平均明顯低于VLPs免疫組(P 0.05),而且?guī)缀鯔z測不到sIgA。被動免疫保護(hù)實驗結(jié)果表明,CVA16 VLPs及滅活疫苗免疫組小鼠均能對1 000LD50同株病毒及400LD50異種病毒的攻擊具有100%的保護(hù)。且最高對于16000LD5o同株病毒的攻擊,VLPs組及CAV組仍分別具有92.3%及90%的保護(hù)力；VLPs免疫組對2400 LD5o異株病毒的攻擊仍具有90%的保護(hù)。病理學(xué)檢測結(jié)果顯示,PBS對照組多個組織器官均出現(xiàn)病理性變化,以后肢肌肉、腸組織、肺臟最為嚴(yán)重；出現(xiàn)了嚴(yán)重的肌纖維萎縮、壞死、炎細(xì)胞浸潤,腸壁水腫壞死、絨毛脫落,肺泡壁增厚、水腫等病理學(xué)變化。CVA16 VLPs及滅活病毒免疫組在各個組織器官(腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、后肢骨骼肌、脊柱骨骼肌及脊髓)均無組織病理學(xué)變化。器官病原學(xué)分布與病理表現(xiàn)基本一致,PBS對照組各個組織器官中均可檢測到大量病毒存在。但免疫組小鼠在后肢骨骼肌組織、腸組織等處可檢測到微量的病毒抗原存在,其余器官病原學(xué)分布皆呈陰性。以上結(jié)果說明CVA16 VLPs可誘導(dǎo)小鼠機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)；且該中和抗體能明顯抑制病毒在小鼠體內(nèi)一些組織器官中的增殖,能在很大程度上夠阻止病毒的感染,有效的保護(hù)機體免受病毒感染所引起的病理損害。本研究闡明了我國CVA16病毒代表株的全基因組基因特征,成功構(gòu)建并證實了CVA16 VLPs具有和滅活疫苗相同的保護(hù)作用,說明CVA16 VLPs疫苗是—種很有開發(fā)前景的候選疫苗。這些結(jié)果為進(jìn)一步對CVA16 VLPs組裝及結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行深入研究、以及進(jìn)行下游的開發(fā)和免疫學(xué)方面的研究提供了參考,為CVA16疫苗的研制提供了重要的實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392-33
【圖文】：

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本文編號：2745367