【摘要】：第一部分孤兒G蛋白偶聯(lián)受體MrgF在傷害性感受中的作用研究利用小鼠基因敲除技術(shù),從整體動(dòng)物水平來研究基因功能、人類疾病發(fā)病機(jī)制、胚胎發(fā)育過程和尋找新的藥物靶點(diǎn),已成為現(xiàn)代生物學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域最常用的技術(shù)手段之一。孤兒G蛋白偶聯(lián)受體MrgF屬于Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一,其配基和生物學(xué)功能未知。該家族大部分成員的mRNA特異性地選擇分布于與痛覺產(chǎn)生和傳導(dǎo)相關(guān)的感覺傳入神經(jīng)元上,提示該家族受體可能參與了對(duì)疼痛的感受和調(diào)節(jié)的神經(jīng)回路。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中通過大量的文獻(xiàn)閱讀和生物信息學(xué)分析,成功建立了MrgF基因剔除小鼠。通過一系列的行為學(xué)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)MrgF基因剔除小鼠與同窩野生型小鼠相比對(duì)外周熱痛覺和癢覺的感受沒有顯著性差異,而在辣椒素和福爾馬林誘導(dǎo)的炎性痛模型上與正常野生型小鼠相比有顯著性改變,表現(xiàn)出對(duì)傷害性疼痛耐受增加,痛敏水平降低。進(jìn)一步的研究中顯示MrgF受體的表達(dá)特異性地分布于小腦的浦肯野細(xì)胞和脊髓背根神經(jīng)節(jié)感受神經(jīng)元上。背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)Creb介導(dǎo)的磷酸化水平影響了疼痛相關(guān)c-fos和Penk基因的表達(dá)。在疼痛產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用的Runx1、電壓門控鈉通道Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9在MrgF基因剔除小鼠都發(fā)生了顯著性下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MrgF受體在傷害感受中扮演著重要的角色,進(jìn)一步補(bǔ)充了對(duì)Mrgs受體家族功能的研究。第二部分Agk基因與線粒體病的相關(guān)性研究線粒體病是由于線粒體DNA或細(xì)胞核DNA遺傳缺損,引起線粒體結(jié)構(gòu)或功能的缺陷致使ATP合成障礙、能量來源不足導(dǎo)致的一組疾病的表現(xiàn)。疾病的癥狀復(fù)雜多樣,確診困難,目前沒有有效的治療方法。通過攜帶有線粒體DNA突變或細(xì)胞核DNA突變的線粒體病小鼠模型研究線粒體功能障礙與疾病的因果關(guān)系,對(duì)發(fā)現(xiàn)新的治療線粒體病的方法有重要意義。Sengers綜合征(MIM 212350)是一類由細(xì)胞核基因AGK突變引起的線粒體病,為常染色體隱性遺傳性疾病。該病的主要臨床癥狀表現(xiàn)為先天性白內(nèi)障、肥厚性心肌病、骨骼肌病變、運(yùn)動(dòng)耐受力缺乏以及乳酸酸中毒。AGK基因結(jié)構(gòu)的改變產(chǎn)生線粒體病的分子機(jī)制目前仍不是很明確。我們通過條件性基因剔除技術(shù)建立了Agk條件性基因剔除小鼠,并進(jìn)一步通過生殖系統(tǒng)表達(dá)的Cre小鼠實(shí)現(xiàn)了Agk基因的全身性敲除。Agk基因剔除純合子小鼠心肌、骨骼肌表現(xiàn)出與人類Sengers綜合征相似的組織病理改變,出現(xiàn)了線粒體氧化磷酸化水平下降和線粒體結(jié)構(gòu)功能受損,但沒有出現(xiàn)Sengers綜合征的先天性白內(nèi)障表型�；蛱蕹兒献有∈驧EF細(xì)胞線粒體膜電位下降,提示Agk基因缺失導(dǎo)致的細(xì)胞異常凋亡,與Sengers綜合征的發(fā)生密切相關(guān)。Agk基因剔除小鼠的建立,有助于我們從整體動(dòng)物水平闡明線粒體病發(fā)生、發(fā)展的生理、病理機(jī)制,并可為尋找新的藥物靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R-332;R402
【圖文】：

rg受體家族是2001年發(fā)現(xiàn)的一類疼痛相關(guān)的新型G蛋白偶聯(lián)受體，的基因與MAS1原癌基因具有35%的同源性，因此命名為Mas相關(guān)G（Mas-related G protein-coupled receptors, Mrgs）[14]。Mrg家族大部NA特異性地以非重疊形式表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion, 神經(jīng)節(jié)（trigeminal ganglion, TG）的傷害感受神經(jīng)元上[14, 15]，這些信息傳入的第一級(jí)神經(jīng)元[16]，因此這些受體被定義為感覺神經(jīng)元特ensory Neuron-Specific Receptors, SNSRs）[15]。這種特異性表達(dá)模式體可能參與了對(duì)疼痛的調(diào)節(jié)的多條神經(jīng)回路。根據(jù)序列同源性，M步被分成很多亞家族，其中MrgA，MrgB和MrgC亞家族僅在嚙齒達(dá)，包含大約50種相關(guān)基因[17]，另外有6種Mrg的單拷貝基因包括，MrgF（RTA），MrgG，MrgH和Mas1在嚙齒類和人類中有明確的同圖1.1）。

側(cè)的效應(yīng)器起作用，而是通過與之偶聯(lián)的G蛋白，進(jìn)一步通過內(nèi)多種下游基因的表達(dá)變化，從而引起細(xì)胞的各種生物學(xué)效應(yīng)、吞噬、分泌、收縮和電生理活動(dòng)等[4, 19]。GPCRs典型的傳遞異性的配體與GPCRs的配體結(jié)合域結(jié)合，導(dǎo)致受體被激活，分化，從而對(duì)下游的G蛋白復(fù)合物產(chǎn)生影響。G蛋白復(fù)合物是由部分組成的異源三聚體，按照Gα亞基的結(jié)構(gòu)和作用的不同，白（Gs）和抑制型G蛋白（Gi），以及Gq和G12，各亞型基因序性[20]。Gs的α亞基Gα在未被激活前，與Gβ和Gγ組成的二聚體體，且被GDP結(jié)合從而呈現(xiàn)無活性狀態(tài)。當(dāng)GPCRs與配體由于構(gòu)象的變化誘發(fā)G蛋白復(fù)合物上的Gα-GDP與GTP交態(tài)的Gα-GTP，同時(shí)，Gα-GTP與Gβγ二聚體分離并移動(dòng)到上的腺苷酸環(huán)化酶部位以激活腺苷酸環(huán)化酶，后者催化作為細(xì)胞內(nèi)第二信使繼續(xù)向下傳遞信號(hào)（圖1.2）[21]。

小鼠 MrgF 基因又稱為 Mrgprf、Mgrc、BC019711，1990 年 Ross 等人克隆了大鼠的 MrgF 基因，他們稱之為 RTA 基因。大鼠的 RTA 基因編碼 343 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，同時(shí)通過 cDNA 文庫比較，發(fā)現(xiàn)該基因是與 MAS1 癌基因有 34%同源性的具有 7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的 GPCRs[51]。MrgF 基因在大部分哺乳動(dòng)物中都有同源基因，包括人類、黑猩猩、恒河猴、牛、豬、嚙齒類等（圖 1）。小鼠 MrgF 基因定位于小鼠 7 號(hào)染色體 F5 區(qū)，長 8.6 kb，包含 3 個(gè)外顯子，開放閱讀框?yàn)?1032 bp，蛋白產(chǎn)物有 343 個(gè)氨基酸。用 Blastp 程序進(jìn)行人與小鼠的 MrgF 蛋白序列比對(duì)，結(jié)果顯示小鼠 MrgF 與人 MRGF 同源性高達(dá) 86%（圖 2）。小鼠 MrgF 蛋白 N 端有 44 個(gè)氨基酸，C 端有 49 個(gè)氨基酸，具有特征性的 7 個(gè) α螺旋跨膜區(qū)（7TM)結(jié)構(gòu)域（圖 3），屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體超家族的視紫紅質(zhì)亞家族（Rhodopsin family G-protein coupled receptors）。作為受體蛋白 MrgF 有 G 蛋白偶聯(lián)受體活性和信號(hào)傳導(dǎo)活性，其配基和生物學(xué)功能未知，是一類孤兒 GPCRs（orphan GPCRs，oGPCRs）。

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本文編號(hào)：2745338