【摘要】：大麻素Ⅰ型受體(cannabinoid type Ⅰ receptor, CB1R)是大麻素受體的一種,隨著它的發(fā)現(xiàn)與克隆,越來(lái)越多的證據(jù)表明CBIR在內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的各種生理作用中扮演了重要的角色。CBIR受體主要存在于神經(jīng)組織中,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)及外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá),并且可以通過(guò)神經(jīng)調(diào)節(jié)和激素調(diào)節(jié)等方式參與哺乳動(dòng)物多種生理活動(dòng)的調(diào)控。在內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(Endogenous cannabinoid system, ECS)的各種生理作用中CBIR受體發(fā)揮著重要的作用。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)紊亂造成非常嚴(yán)重的的危害,CBIR受體拮抗劑能夠調(diào)節(jié)ECS的過(guò)度活化狀態(tài)從而使其重建平衡減少危害。使用CBIR受體拮抗劑阻斷CBIR受體拮抗劑可以減少食物攝入和脂肪堆積,同時(shí)還可以氧化游離脂肪酸,減少脂肪細(xì)胞分泌的不良因子,提高脂聯(lián)素的水平,對(duì)于促進(jìn)脂肪代謝和糖類(lèi)代謝是非常有益的；此外CBIR受體拮抗劑還可以通過(guò)降低體重、減小腰圍并改善各種代謝危險(xiǎn)因素來(lái)達(dá)到降低心血管疾病危險(xiǎn)的效果；分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的CBIR受體,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中對(duì)于緩解和預(yù)防疼痛也具有一定的作用,相關(guān)研究表明CBIR受體拮抗劑通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,在疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用；在成癮性方面,激活CBIR受體可以調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,如多巴胺(DA)、Υ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu),這些物質(zhì)與藥物渴求、復(fù)發(fā)等過(guò)程皆有一定的相關(guān)性,分泌DA的中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)及其主要投射區(qū)伏隔核在成癮藥物的刺激效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明在大鼠VTA內(nèi)注射嗎啡或伏隔核內(nèi)注射苯丙胺可恢復(fù)其對(duì)海洛因或可卡因的需求。中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABA中間神經(jīng)元的軸突末梢也含有大量CBIR受體,激動(dòng)這些受體可以抑制GABA的釋放,而GABA對(duì)DA投射神經(jīng)元能發(fā)揮抑制作用,也就是說(shuō),在VTA水平上激動(dòng)CBIR受體可以促進(jìn)DA的釋放。CBIR受體拮抗劑不僅能夠抑制成癮行為,降低對(duì)成癮物質(zhì)的依賴(lài)性還可以防止成癮行為的復(fù)發(fā)。關(guān)于大麻素對(duì)藥物需求的調(diào)節(jié)作用機(jī)制還不是非常清楚,目前的研究認(rèn)為CBIR受體高度表達(dá)的腦區(qū)在復(fù)吸行為及條件反射過(guò)程中具有重要作用,這些腦區(qū)包括前額葉皮質(zhì)、杏仁核、伏隔核、紋狀體和海馬。更為重要的是,最近關(guān)于人腦成像的研究顯示,藥物成癮時(shí)的暗示誘發(fā)性渴求也具有類(lèi)似的壞路。大麻素受體激動(dòng)劑很有可能是通過(guò)增強(qiáng)中間神經(jīng)遞質(zhì)DA的釋放而促進(jìn)對(duì)海洛因或可卡因的渴求的。由此可見(jiàn),CBIR受體的進(jìn)一步深入研究具有明顯的意義,而國(guó)內(nèi)關(guān)于其單克隆抗體的制備以及使用的報(bào)告還比較少,大部分為CBIR受體的多克隆抗體,那么成功制備出CBIR受體的單克隆抗體就是非常有必要的。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用多種軟件預(yù)測(cè),設(shè)計(jì)出了三條符合要求的CBIR氨基酸序列,然后通過(guò)馬來(lái)酰亞胺基類(lèi)活波酯法(MBS)將合成肽鏈與鑰孔戚藍(lán)蛋白(KLH)交聯(lián)制成供免疫用的免疫原,之后分別免疫Balb/c雌性小鼠,第二次免疫后第九天取小鼠尾部血清分別測(cè)定免疫小鼠的尾血效價(jià)和抑制,根據(jù)測(cè)定結(jié)果選取效價(jià)高、抑制反應(yīng)好的小鼠脾細(xì)胞作為融合細(xì)胞供體與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。融合后的細(xì)胞及時(shí)篩選、克隆,最終得到五株具有穩(wěn)定分泌CBIR抗體能力的單克隆細(xì)胞。對(duì)得到的細(xì)胞株進(jìn)行抗體效價(jià)、親和力、抗體的類(lèi)與亞型的鑒定,發(fā)現(xiàn)所得抗體的亞型為IgGl和IgG2b,輕鏈為K鏈,并且用純化的腹水進(jìn)行免疫組織化學(xué)和蛋白印跡的進(jìn)一步檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),制備的抗體效價(jià)高、親和力好,并且可以用于免疫組化和蛋白印跡的研究。
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2745147