【摘要】：貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii,簡(jiǎn)稱(chēng)C.burnetii)是一類(lèi)世界范圍廣泛分布的革蘭陰性胞內(nèi)寄生菌,該菌通常以氣溶膠吸入的方式傳播感染人,引起人類(lèi)急性或慢性Q熱病。傳統(tǒng)上,由于貝氏柯克斯體與立克次體具有相似的生物學(xué)特性,因而又俗稱(chēng)Q熱立克次體。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)貝氏柯克斯體與立克次體科內(nèi)其他成員的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),在第二版的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中該菌歸屬于軍團(tuán)菌目、柯克斯體科、柯克斯體屬。值得注意的是,該病原體對(duì)高滲透壓、干燥脫水等環(huán)境具有極強(qiáng)的抵抗存活特性,是一類(lèi)經(jīng)典的生物戰(zhàn)劑與生物恐怖劑。脂多糖(Lipopolysaccharide,簡(jiǎn)稱(chēng)LPS)是大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌菌體外膜的主要結(jié)構(gòu),是一種重要的毒力因子。除少數(shù)菌例外如沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,簡(jiǎn)稱(chēng)Ct)等,均由類(lèi)脂A、核心糖、多糖(O抗原)三部分組成,是重要的毒力因子與保護(hù)性抗原。類(lèi)脂A是革蘭陰性菌的內(nèi)毒素,葡萄糖胺結(jié)構(gòu)的雙糖脂,脂多糖的基礎(chǔ)組分。目前除少數(shù)菌如腦膜炎奈瑟氏菌、卡他莫拉菌和鮑曼不動(dòng)桿菌之外,Kdo-lipid A為大多數(shù)革蘭陰性菌正常生長(zhǎng)繁殖的必需結(jié)構(gòu)。LpxC是類(lèi)脂A合成途徑中催化第一步脫乙�；磻�(yīng)的保守酶,該反應(yīng)不可逆,常被用作革蘭陰性菌抗生素的設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。新型小分子化合物抑制劑如LPC-011、CHIR-90能夠特異性結(jié)合抑制LpxC的活性,從而有效抑制類(lèi)脂A的合成,達(dá)到化學(xué)法敲除類(lèi)脂A的目的。近年來(lái),關(guān)于貝氏柯克斯體脂多糖的研究中,類(lèi)脂A的生物學(xué)作用與功能目前仍不明確。我們通過(guò)使用新型小分子LpxC抑制劑LPC-011、CHIR-90等,在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基(ACCM-2)、猴腎細(xì)胞系(Vero、BGMK)、巨噬樣THP-1細(xì)胞等多種貝氏柯克斯體的培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)研究了類(lèi)脂A對(duì)于菌體生長(zhǎng)繁殖的重要性,初步分析了其生物學(xué)功能。此外,以無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)體系為研究平臺(tái),利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選出多個(gè)與菌體耐高滲透壓適應(yīng)性存活特性相關(guān)的蛋白。首先,初步研究發(fā)現(xiàn):初始加入單一高濃度的抑制劑LPC-011并不影響I相、II相貝氏柯克斯體在Vero細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖,這提示類(lèi)脂A對(duì)于貝氏柯克斯體在該環(huán)境下的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程可能并不重要。然而,由于缺乏有效的類(lèi)脂A檢測(cè)方法以及貝氏柯克斯體LpxC對(duì)于抑制劑的敏感性未知,因此并不能得出關(guān)于類(lèi)脂A必要性的準(zhǔn)確結(jié)論。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)貝氏柯克斯體LpxC對(duì)于抑制劑LPC-011的敏感性(MIC),利用遺傳操作將貝氏柯克斯體lpxC基因引入大腸埃希菌(E.coli,簡(jiǎn)稱(chēng)大腸桿菌),同時(shí)敲除大腸桿菌內(nèi)源染色體上的lpxC完成構(gòu)建大腸桿菌替代測(cè)試模型。在大腸桿菌替代模型中對(duì)比測(cè)試發(fā)現(xiàn),抑制劑LPC-011對(duì)貝氏柯克斯體LpxC的最低抑制濃度小于0.05μg/ml,且小于LPC-011對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度。這提示我們可以利用大腸桿菌作為參考指標(biāo),判斷抑制劑的穩(wěn)定性與抑制效果�？紤]到貝氏柯克斯體的培養(yǎng)周期長(zhǎng)達(dá)7天,且抑制劑LPC-011在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不穩(wěn)定等特點(diǎn),利用大腸桿菌的生長(zhǎng)指標(biāo)OD_(550)作為參照,評(píng)價(jià)抑制劑LPC-011的抑制效果。發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞環(huán)境中,初始加入大腸桿菌致死劑量(2μg/ml40×MIC)的LPC-011能夠在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定的大腸桿菌抑菌濃度。因此間隔48 h更換含有2μg/ml LPC-011的培養(yǎng)液可保持大腸桿菌抑菌濃度。然而,在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)體系中,初始加入5μg/ml LPC-011經(jīng)培養(yǎng)7天后,仍可維持大腸桿菌抑菌濃度。由于缺乏類(lèi)脂A檢測(cè)手段,實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了穿梭載體pMMBGK,進(jìn)而引入衣原體kdtA成功構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pMMBGKkdt A。以上兩種質(zhì)粒均具有RSF1010復(fù)制起始位點(diǎn)。將質(zhì)粒pMMBGKkdt A電轉(zhuǎn)化進(jìn)入貝氏柯克斯體九里II株,使衣原體Kdo轉(zhuǎn)移酶Kdt A表達(dá),催化合成衣原體屬特異性Kdo側(cè)鏈,修飾貝氏柯克斯體類(lèi)脂A,將Kdo_2-lipid A修飾形成Kdo_3-lipid A,在貝氏柯克斯體外膜形成可被抗衣原體屬特異性單抗識(shí)別的α-Kdo-(2→8)-α-Kdo表位結(jié)構(gòu)。在抑制劑LPC-011作用下,通過(guò)間接免疫熒光染色驗(yàn)證了貝氏柯克斯體類(lèi)脂A的合成確實(shí)受到顯著抑制,同時(shí)親代轉(zhuǎn)化菌在非吞噬細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境內(nèi)的拷貝數(shù)產(chǎn)量下降。經(jīng)抑制劑培養(yǎng)所得子代菌體能夠正常感染吞噬、非吞噬細(xì)胞,但在LPC-011的作用下幾乎不能在吞噬細(xì)胞THP-1中進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。然而,類(lèi)脂A修飾菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能完全替代野生型貝氏柯克斯體的測(cè)試結(jié)果。在對(duì)野生型I相、II相貝氏柯克斯體的測(cè)試研究中發(fā)現(xiàn),在BGMK細(xì)胞培養(yǎng)體系中,LPC-011降低了囊泡數(shù)量(約60%~70%),但是已發(fā)育成熟囊泡內(nèi)菌體的生長(zhǎng)繁殖未受影響。有意思的是,經(jīng)LPC-011處理的I相菌體,其囊泡內(nèi)菌體的生長(zhǎng)表型仍表現(xiàn)為分散的布朗運(yùn)動(dòng),這提示完整的脂多糖可能并不是導(dǎo)致I相菌體親水性的唯一原因。在經(jīng)抑制劑LPC-011處理的THP-1細(xì)胞中,貝氏柯克斯體僅可形成缺陷生長(zhǎng)的小囊泡,同時(shí)菌體拷貝數(shù)下降顯著。經(jīng)LPC-011培養(yǎng)所得子代菌仍可感染THP-1細(xì)胞、在胞內(nèi)正常生長(zhǎng)。由于貝氏柯克斯體發(fā)育過(guò)程中包含形態(tài)迥異的小貝氏體(SCV,直徑0.2~0.5μm)、大貝氏體(LCV,直徑1μm)的雙相發(fā)育周期,因此使用透射電子顯微鏡(TEM)分析類(lèi)脂A對(duì)于菌體的形態(tài)學(xué)發(fā)育變化的生物學(xué)作用,發(fā)現(xiàn)在LPC-011處理的吞噬、非吞噬細(xì)胞中,類(lèi)脂A并不是大貝氏體向小貝氏體發(fā)育變化的必需結(jié)構(gòu)。另外,通過(guò)改變無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)體系中Na~+與Cl~-濃度來(lái)大量獲取不同滲透壓梯度下的菌體,并分別對(duì)三組:超高滲、正常高滲、低滲環(huán)境所得菌體蛋白進(jìn)行雙向電泳分析銀染顯色�；诘鞍c(diǎn)灰度值,用軟件對(duì)比分析得出三組滲透壓條件下表達(dá)量具有顯著性差異的13個(gè)蛋白,進(jìn)行質(zhì)譜(Maldi-TOF-MS)分析。其中,超高滲組中Gro ES、EF-Tu、RopC、IcmK、RplL蛋白以及假定蛋白(CBU_0632)的表達(dá)量均升高10倍以上。低滲組中,蛋白GcvH、Bcp、Dot C、、RuvB、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、以及假定蛋白(CBU_0658)的灰度變化均達(dá)10倍以上。綜上所述,本研究通過(guò)使用抑制劑LPC-011在多種培養(yǎng)體系內(nèi)鑒定了貝氏柯克斯體類(lèi)脂A的生物學(xué)作用,利用大腸桿菌替代模型測(cè)試了貝氏柯克斯體LpxC對(duì)于LPC-011的敏感性,建立了一個(gè)基于間接免疫熒光染色的貝氏柯克斯體類(lèi)脂A檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng),進(jìn)而提出證據(jù)證明貝氏柯克斯體類(lèi)脂A在三種培養(yǎng)環(huán)境下(猴腎成纖維細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基),具有不同的生物學(xué)作用。另外,通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定得出與菌體耐高滲透壓特性相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本研究為下一步構(gòu)建貝氏柯克斯體類(lèi)脂A無(wú)痕刪除突變株奠定了基礎(chǔ),為更加深入分析類(lèi)脂A的生物學(xué)功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)臨床上治療急性、慢性Q熱提供了新的思路。也為進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平研究貝氏柯克斯體耐高滲透壓的遺傳學(xué)機(jī)制、驗(yàn)證相關(guān)基因的生物學(xué)功能提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R376
【圖文】：

圖 1.1 脂多糖合成途徑與 LpxC 抑制劑作用機(jī)制示意圖抑制劑（LPC-011，CHIR-90）特異性結(jié)合抑制 LpxC 的活性，進(jìn)而有效抑制革蘭陰性菌類(lèi)脂 A 與脂多糖的合成。圖 1.2 LPC-011 結(jié)合抑制 LpxC 三維結(jié)構(gòu)示意圖

第 7 頁(yè)圖 1.2 LPC-011 結(jié)合抑制 LpxC 三維結(jié)構(gòu)示意圖細(xì)胞與質(zhì)粒名稱(chēng) 來(lái)源氏柯克斯體九里 II 相菌株柯克斯體 Henzerling I 相菌株 coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞E. coli TOP10 感受態(tài)細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室收集保存本實(shí)驗(yàn)室收集保存天根生化科技有限公司（北天根生化科技有限公司（北

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文入單一高濃度（2 μg，>40×MIC）抑制劑 LPC-011 抑制貝氏柯克斯體類(lèi)脂 A 的合成。利用相差顯微鏡連續(xù)觀察囊泡、菌體的生長(zhǎng)繁殖形態(tài)。觀察抑制劑 LPC-01對(duì)貝氏柯克斯體生長(zhǎng)表型的影響，初步判斷類(lèi)脂 A 對(duì)于貝氏柯克斯體在胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中是否具有重要的生物學(xué)作用。如圖 1.3 所示。

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本文編號(hào)：2744467