【摘要】：目的:我們將人多能干細胞(hESCs)與小鼠主動脈-性腺-中腎區(qū)基質(zhì)細胞(AGM-S3)共培養(yǎng)獲得造血干/祖細胞,利用微球、膠原蛋白、透明質(zhì)酸、多肽、纖維蛋白等構(gòu)建的三維(以下簡寫為3D)材料在體外模擬造血微環(huán)境,定向誘導(dǎo)體外獲得的造血干/祖細胞向成熟紅細胞分化,并通過MGG染色、流式細胞術(shù)、免疫染色、PCR等手段分析誘導(dǎo)后收獲的細胞,建立體外運用3D手段培養(yǎng)紅系細胞的方法。方法:一、材料選擇:選取魔芋葡聚糖微球、膠原微球、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、多肽、纖維蛋白等構(gòu)建3D材料,進行紅細胞體外定向誘導(dǎo)分化實驗,篩選出本實驗室條件下最佳的紅細胞體外3D培養(yǎng)條件。二、細胞培養(yǎng):本實驗所用的胚胎干細胞系為H1細胞系。我們將H1與AGM-S3基質(zhì)細胞共培養(yǎng)14天后收集細胞并進行CD34+磁珠分選實驗,隨后在無血清培養(yǎng)基SF-HSC[SFEM-2,SCF(50 ng/ml),FLT-3(50 ng/ml),TPO(50 ng/ml)]中擴增3-5天,此時CD34+CD45+細胞數(shù)達到其峰值。隨后將細胞接種于不同3D材料與普通液體培養(yǎng)皿中,在無血清紅系定向誘導(dǎo)7因子培養(yǎng)基[SFEM-2,VEGF(20ng/ml),SCF(100 ng/ml),IL-3(5 ng/ml),IL-6(50 ng/ml),FLT-3(5 ng/ml),TPO(50 ng/ml),EPO(4IU/mL);縮寫為 SF-RBC-7FCs]中培養(yǎng)5天,繼而更換為3因子培養(yǎng)基[SFEM-2,SCF(100 ng/ml),IL-3(5ng/ml),EPO(4IU/mL);縮寫為SF-RBC-3FCs]繼續(xù)培養(yǎng)9天。于紅系定向分化后第7或14天后收集細胞,并進行細胞數(shù)量檢測、MGG染色、流式分析、免疫染色及相關(guān)基因表達情況檢測,比較不同培養(yǎng)條件下獲得的紅細胞的差異,確定本實驗室內(nèi)紅細胞分化的最佳3D培養(yǎng)條件。結(jié)果:我們在hESCs與AGM-S3基質(zhì)細胞共培養(yǎng)14天后收集細胞,在SF-HSC培養(yǎng)基中擴增3-5天后將收獲的細胞接種于不同3D材料與普通液體培養(yǎng)皿中,在無血清紅系定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基下培養(yǎng)第7或14天后收集細胞,并進行細胞數(shù)量檢測、流式分析等,比較不同培養(yǎng)條件下獲得紅系細胞的差異。結(jié)果表明,對于紅細胞的擴增,液體培養(yǎng)優(yōu)于兩種微球所建立的3D培養(yǎng)體系;在水凝膠及支架培養(yǎng)體系中,以膠原蛋白為基礎(chǔ)構(gòu)建的支架3D培養(yǎng)體系要優(yōu)于其他物質(zhì)構(gòu)建的水凝膠或支架3D材料。結(jié)論:1.以膠原微球、魔芋葡聚糖微球建立的3D培養(yǎng)方法不利于紅系細胞生長,紅系定向誘導(dǎo)14天后細胞數(shù)量及紅細胞成熟度皆較液體培養(yǎng)低。2.膠原支架對紅細胞的擴增能力明顯優(yōu)于液體培養(yǎng)及其他材料構(gòu)建的水凝膠或支架3D培養(yǎng)體系,且膠原支架中獲得的紅細胞在成熟度上與液體培養(yǎng)無顯著性差異。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2
【圖文】：

造血千／祖細胞，經(jīng)過或無需ＣＤ３４＋細胞磁珠分選實驗，隨后在ＳＦ－ＨＳＣ［ＳＦＥＭ－２，逡逑ＳＣＦ邋（５０邋ｎｇ／ｍｌ），ＦＬＴ－３邋（５０邋ｎｇ／ｍｌ）邋，邋ＴＰ０邋（５０邋ｎｇ／ｍｌ）］中對邋ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋逡逑細胞群擴增３－５天，此時⑶３４＋ＣＤ４５＋細胞群比例顯著升高（見圖１Ａ），通過逡逑比較培養(yǎng)前與培養(yǎng)后未分選細胞及分選細胞獲得的總細胞數(shù)量和ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋逡逑細胞數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)未分選細胞擴增后總細胞數(shù)量略降低，但⑶３４＋ＣＤ４５＋細逡逑胞數(shù)量增多，擴增倍率為２．邋７１，系未分選細胞中含有較多ＡＧＭ細胞及不參與逡逑造血的其他細胞，這些細胞在培養(yǎng)過程中會死亡，但未分選細胞中的一些基質(zhì)逡逑細胞有支持造血干／祖細胞擴X椀淖饔茫虼刷牽常矗茫模矗擔(dān)赴吭齠唷７盅″義蝦笙赴櫻疲齲櫻門嘌┰齪�，总细胞数量及ＣＤ３４＋ＣＤ４�(dān)赴烤黽櫻義希咤蝸啾扔諗嘌�，ＣＤ３４＋ＣＤ４�(dān)赴康睦┰霰堵飾保澹梗怠Ｋ淙輝冢櫻疲齲櫻門嘌義蝦�，分选后细胞中ＣＤ３４＋ＣＤ４�(dān)赴康睦┰霰堵事緣陀諼捶盅∠赴�，但钒櫫x涎『笙赴校茫模常矗茫模矗擔(dān)赴壤細咔易蓯坑龐諼捶盅∠赴

本文編號：2743055