【摘要】：背景為了得到高親和力以及高特異性的抗體,抗體的制備已經(jīng)經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的發(fā)展史,現(xiàn)在抗體的制備主要有雜交瘤技術(shù)以及基因工程技術(shù)�；蚬こ碳夹g(shù)中利用scFv文庫(kù)來篩選獲得單鏈抗體是最為常見的抗體篩選方法,這種抗體具有特異性高等優(yōu)點(diǎn),但是此種方法得到的抗體由于其尺寸以及親和力等方面的限制,常常表現(xiàn)為穩(wěn)定性較差。研究發(fā)現(xiàn),在羊駝外周血液中存在一種天然缺失輕鏈的抗體,該抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(VHH)和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū),但卻不像人工改造的單鏈抗體片段(scFv)那樣容易相互沾粘,甚至聚集成塊。更重要的是這種抗體具有與雙鏈抗體一樣的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及與抗原的結(jié)合活性,是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位,稱之為納米抗體(Nbs)。從駱駝科中提取得到的納米抗體由于其更小的尺寸等生化特性,穩(wěn)定性好,因此比常規(guī)抗體平臺(tái)更具有優(yōu)勢(shì)。納米抗體已證明具有作為治療分子和臨床診斷工具的巨大價(jià)值。獲得Nbs的常規(guī)程序是用抗原免疫駱駝,但當(dāng)抗原具有高毒性,致病性或非免疫原性時(shí),不能免疫駱駝,因此對(duì)抗原有一定的限制。合成納米抗體庫(kù)對(duì)于待篩選的抗原沒有限制,使用起來更為便利。常規(guī)單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)有六個(gè),然而有研究發(fā)現(xiàn),來源于駱駝科的納米抗體由于具有自然界中最小的抗體分子量,因此它的互補(bǔ)決定區(qū)只有三個(gè),但是CDR的減少并不會(huì)影響納米抗體的抗體功能,其中納米抗體的CDR3具有最大的多樣性,對(duì)于納米抗體的功能最為重要。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是抗體基因文庫(kù)技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù)相結(jié)合形成的一項(xiàng)新技術(shù)與方法,在生物科學(xué)領(lǐng)域極具潛力。噬菌體抗體即在噬菌體表面表達(dá)有抗體分子的單鏈?zhǔn)删w,這種表面表達(dá)是通過抗體與單鏈?zhǔn)删w外殼蛋白(PⅢ或PⅧ)形成融合蛋白而完成的,這樣一來噬菌體DNA中有抗體基因的存在,同時(shí)在其表面又有抗體分子的表達(dá),就可以方便地利用抗原—抗體特異性結(jié)合的原理,通過多輪的抗原吸附-洗脫-擴(kuò)增,而篩選出所需要的抗體。在本研究中,選取駱駝VHH框架作為支架,并隨機(jī)化其中CDR3的氨基酸序列,構(gòu)建合成了具有多樣性的納米抗體合成庫(kù),將Taq DNA聚合酶以及免疫球蛋白抗體(IgG)作為篩選抗原,使用噬菌體展示技術(shù),最終從納米抗體合成庫(kù)中篩選得到兩種抗原的親和性抗體。目的構(gòu)建納米抗體合成庫(kù),在納米抗體合成庫(kù)的平臺(tái)上,利用噬菌體展示技術(shù)篩選Taq DNA聚合酶以及抗免疫球蛋白的高親和性抗體。方法1.基于駱駝保守單結(jié)構(gòu)域抗體片段(VHH)框架,通過合成寡核苷酸的隨機(jī)化將多樣性引入互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3),構(gòu)建了大型且多樣化的納米抗體合成文庫(kù)。2.原核表達(dá)并純化Taq DNA聚合酶,并檢測(cè)其酶活性。3.利用噬菌體展示技術(shù),從該文庫(kù)中篩選Taq DNA聚合酶以及抗免疫球蛋白特異性的親和性抗體。結(jié)果1.成功構(gòu)建納米抗體合成庫(kù),庫(kù)容為10~8以上。2.成功構(gòu)建并原核表達(dá)純化出具有酶活性的Taq DNA聚合酶,能夠?qū)崿F(xiàn)在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用,成功催化PCR反應(yīng)。3.成功篩選到Taq DNA聚合酶以及抗免疫球蛋白的親和性抗體。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的納米抗體合成庫(kù)多樣性豐富,并且具有應(yīng)用價(jià)值,為后續(xù)的其他抗體的篩選提供了良好的平臺(tái)。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392-33
【圖文】：

圖 2 1：VHH 抗體片段的合成片段和引物交由金唯智公司合成：：5′-CAA GTT CAA TTG GTT GAA TCT GGT GGT GGT TCTT TCT TTG AGA TTG TCT TGT ACT GCT TCT GGT GGT TCT ACT TTT TCT TTG GGT TGG TTT AGA CAA GCT CCAA GCT GTT GCT GCT ATT GCT TCT ATG GGT GGT TTG ACT GTT AAA GGT AGA TTT ACT ATT TCT AGA GAT AAT GCTT TTG CAA ATG AAT AAT TTG AAA CCA GAA GAT ACT GC GCT-3′GAAT GGCCCAGCCGGCC CAA GTT CAA TTG GTT GAA-3′GC AGC ACA ATA ATA AAT -3′AAAT GGCCCCCGAGGCC GA AGA AGA AAC AGT AAC TTGA MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN AGC AGC ACA ATA ATA AAT A-3′

圖 3-1. PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果1-R1 不對(duì)稱 PCR（321bp ）2. R2 DNA（ 1203. F1-R1 與 R2 重疊延伸 PCR（422bp）切之后，進(jìn)行膠回收，取 5ul 進(jìn)行 2％瓊脂片段，條帶單一并且位置正確，如圖 3-2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 唐笑;耐熱DNA聚合酶的定點(diǎn)誘變及應(yīng)用于熱啟動(dòng)PCR的納米抗體的淘選[D];南昌大學(xué);2015年

2 郭佳;Taq DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)修飾與表征[D];廈門大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2742591