【摘要】：本課題組在臨床研究的基礎上預開展“溫針灸對大鼠膝骨性關節(jié)炎軟骨退變作用機制的研究”,在查閱文獻時發(fā)現膝關節(jié)骨性關節(jié)炎造模方法較多,藥物選擇和用量、手術部位、模型形成時間上眾說紛紜,差別較大,給骨性關節(jié)炎的基礎研究帶來較多問題。目的:本實驗從文獻中挑選出三種造模方法,其中藥物注射法選取文獻報道較多的4%的木瓜蛋白酶溶液、0.03mol/L的L-半胱氨酸溶液按2:1的比例混勻,以0.1mL/kg的量注射膝關節(jié);手術法采用文獻報道較多的前交叉韌帶切斷法及膝關節(jié)以屈曲位持續(xù)制動法。通過對SD大鼠膝關節(jié)骨性關節(jié)炎三種模型在各個時間段的效果比較,明確各組模型形成骨性關節(jié)炎的時間,并綜合分析選擇更為理想的動物模型,為下一步溫針灸對大鼠膝骨性關節(jié)炎軟骨退變作用機制的研究奠定基礎。方法:將128只SPF級健康雄性SD大鼠隨機分為A組空白組、B組制動組、C組木瓜蛋白酶組、D組手術組,每組32只,各組均以大鼠的右膝建立模型。B組將大鼠膝關節(jié)以屈曲位持續(xù)制動;C組將4%的木瓜蛋白酶溶液、0.03mol/L的L-半胱氨酸溶液按2:1的比例混勻,以0.1mL/kg的量于實驗的第1、4、7天行右膝關節(jié)腔注射;D組采用ACLT法即前交叉韌帶切斷術;空白組大鼠只抓取。每天記錄各組大鼠的一般狀態(tài),在實驗開始的2、4、6、8周的最后一天,分四批處理各組大鼠,每組每次8只。進行行為學觀察,對各組大鼠按LequesneMG法進行評分;用WAGNER壓痛儀測大鼠痛閾;取大鼠右后肢進行影像學觀察;取大鼠右膝關節(jié),對軟骨表面進行大體觀察評分,HE染色切片并進行病理觀察。結果:1.軟骨大體觀察評分、LequesneMG評分、痛閾各組組內比較:(1)A組大鼠整個實驗過程中表現正常,右膝關節(jié)軟骨表面均光滑、透明,各時間段右膝關節(jié)均未見腫脹,按壓時未見明顯疼痛反應,大鼠奔跑時踏地有力、步態(tài)正常,膝關節(jié)活動范圍正常,整個實驗過程中未見明顯改變。大鼠在2、4、6、8周的痛閾相互比較,均無顯著差異(P0.05),提示空白組未出現骨性關節(jié)炎的表現。(2)B組大鼠軟骨大體觀察評分、LequesneMG評分、痛閾在第2周、4周、6周差異性顯著(P0.05),第8周與第2周、4周比較差異顯著(P0.05),第6周與第8周比較差異不具有顯著性(P0.05)。(3)C組大鼠LequesneMG評分、痛閾在第2周、4周、6周、8周差異性顯著(P0.05);6周與8周軟骨大體觀察評分比較差異不具有顯著性(P0.05),其余兩兩比較差異均顯著(P0.05)。(4)D組大鼠軟骨大體觀察評分、LequesneMG評分、痛閾在第4周、6周時差異性不顯著(P0.05),其余時間段兩兩相比差異均顯著(P0.05)。2.軟骨大體觀察評分、LequesneMG評分、痛閾各組組間比較:(1)組間軟骨大體觀察評分比較:B、C、D組與A組在2、4、6、8周評分差異有統計學意義(P=0.0000.05),2、4周時B組評分高于其他兩組,6周時三組評分區(qū)別不大、D組略高,8周時C、D組高于B組。(2)組間Lequesne MG評分比較:B、C、D組與A組在2、4、6、8周評分差異有統計學意義(P=0.0000.05),2、4周時D組評分高于其他兩組,6、8周時B組相對較高。(3)組間痛閾的比較:(1)2周后B、C、D組與A組比較,P0.05,有統計學差異。C、D組與B組比較,P0.05,無統計學意義,C、D組比較,P0.05,有統計學差異。(2)4周后B、C、D三組與空白組比較痛閾明顯降低,P0.05,有統計學差異。B、C、D組相互比較,P0.05,無統計學意義。(3)6周后B、C、D三組與空白組比較痛閾顯著降低,P0.05,有統計學差異;B、C組、B、D組比較,P0.05,無統計學意義;C、D組比較,P0.05,有統計學差異。(4)造模8周后B、C、D三組與空白組比較痛閾顯著降低,P0.05,有統計學差異;B、C、D組相互比較,P0.05,無統計學意義。3.大鼠膝關節(jié)正側位X線片顯示:(1)A組大鼠2、4、6、8周時膝關節(jié)正側位片均未見明顯異常。(2)B組大鼠2周時膝關節(jié)正側位片均未見明顯異常;4周時,髁間嵴有輕微增生;6周時,髁間嵴及脛骨內側緣增生,關節(jié)面輪廓粗糙,關節(jié)間隙略變窄;8周時,關節(jié)內外側間隙不一致、略有變窄,關節(jié)面不光滑、髁間嵴變尖,關節(jié)軟骨高密度影。(3)C組大鼠2周時膝關節(jié)正側位片均未見明顯異常;4周時,髁間嵴有輕微增生;6周時,髁間嵴及脛骨內側緣增生,關節(jié)面輪廓不光滑,關節(jié)間隙略顯變窄;8周時,關節(jié)內外側間隙不一致、有變窄,關節(jié)面不光整、髁間嵴變尖,關節(jié)軟骨高密度影。(4)D組大鼠2周時,膝關節(jié)正側位片均未見明顯異常;4周時,髁間嵴有輕微增生,關節(jié)內外側間隙一致,未見明顯狹窄,骨性關節(jié)面較光滑、關節(jié)面輪廓清晰完整;6周時與4周表現基本一致;8周時,關節(jié)內外側間隙不一致、有變窄,關節(jié)面不光整、髁間嵴變尖,關節(jié)軟骨高密度影。4.軟骨組織HE染色結果:(1)A組2、4、6、8周的HE染色切片均為觀察到異常表現,軟骨表層光滑平整,軟骨細胞數量正常、分布均勻,排列整齊,層次清晰,無血管侵入,潮線完整,基質染色正常。(2)B組2周時,HE染色正常,軟骨表層光滑整齊,軟骨細胞數量正常且分布均勻,層次清晰,潮線完整,基質染色均勻、無失染;4周時,軟骨表層不平整,無裂隙形成,彌漫性細胞過多,基質染色正常或輕染,鏡下見軟骨組織輕微損傷;6周時,鏡下表現為中度損傷,軟骨表層不平整,有裂隙達過渡帶,細胞數目減少、排列不整齊,潮線有殘缺,基質輕染;8周時,鏡下觀察為中度損傷,軟骨表面不光滑,有達放射帶的裂隙,細胞數目減少,基質輕染,潮線不完整。(3)C組注射木瓜蛋白酶后2周,光鏡下未見明顯異常;4周后,鏡下觀察有輕度損傷,軟骨表層不平整,無裂隙形成,彌漫性細胞數量變多、分布不均,層次不清,潮線基本完整,基質染色不勻,鏡下見軟骨組織輕微損傷;6周后,鏡下表現為中度損傷,軟骨表層不光滑,細胞數目減少、排列不整齊,潮線有殘缺,有血管翳形成,基質輕染;8周后,鏡下觀察為中度損傷,軟骨表面不光滑,有達放射帶的裂隙形成,細胞數目減少、排列不整齊,基質輕染,潮線不完整。(4)D組前交叉韌帶切斷后2周后,HE染色未見明顯異常;4周后,關節(jié)軟骨表現為輕微損傷,軟骨表層不光滑,細胞有簇狀分布,層次尚清晰,基質染色不均,潮線尚完整;6周后,表現為輕度損傷,軟骨表層被破壞,細胞呈簇分布,基質輕染,潮線不完整;8周后,表現為中度損傷,軟骨表面不光滑,局部有達輻射帶的裂隙形成,細胞分布不均,基質染色淺,潮線不完整。結論:(1)制動法、關節(jié)腔注射木瓜蛋白酶法、前交叉韌帶切斷法均能成功建立與人類膝關節(jié)骨性關節(jié)炎相似的動物模型。(2)制動組大鼠持續(xù)制動4周后表現為早期骨性關節(jié)炎,6、8周相當于人類KOA中期;木瓜蛋白酶組與制動組類似,4周為早期,6、8周出現KOA中期表現;手術組4、6周為KOA早期,8周為中期。(3)關節(jié)腔注射木瓜蛋白酶法操作簡便,動物生存質量相對較高,4周為KOA早期,6、8周為中期,是相對理想的造模方法。
【學位授予單位】：山西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R684.3;R-332
【圖文】：

大鼠屈曲位制動圖

2018 屆碩士學位論文6圖 2 大鼠前交叉韌帶切斷術過程圖2.2.4 空白對照組給予大鼠同其他組大鼠同樣的抓取。處理后，各組大鼠群居、自由活動及進食、飲水。2.3 觀察指標每天記錄各組大鼠的一般狀態(tài)，在實驗開始的第 2、4、6、8 周的最后一天，分四批處理各組對應時間窗口的大鼠。進行行為學觀察，對各組大鼠按改良版 LequesneMG 法[13]（見附錄表 1 所示）進行評分；用 WAGNER 壓痛儀測大鼠痛閾；取大鼠右后肢進行影像學觀察；獲取大鼠膝關節(jié)軟骨，對膝關節(jié)軟骨進行大體觀察評分，HE染色切片并進行病理觀察。2.3.1 一般情況觀察及膝關節(jié)軟骨大體觀察評分仔細觀察并記錄大鼠的精神狀態(tài)、姿勢、皮毛色澤、活動度、飲水、大便等全身情況。在處死大鼠時，剝離大鼠右膝關節(jié)外肌肉層，切斷膝關節(jié)所有韌帶，打開關節(jié)腔，充分暴露股骨髁和脛骨平臺，觀察關節(jié)面軟骨顏色、質感、形狀和光滑程度。按照以下評分標準對大鼠右膝關節(jié)軟骨進行大體觀察評分[14]：軟骨表面光滑、透明-0分； 軟骨表面光滑，而有瑕疵-1 分；軟骨表面光滑，為乳白色不透明狀-2 分；軟骨表面不光滑

【參考文獻】

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本文編號：2742140