【摘要】：本課題組在臨床研究的基礎(chǔ)上預(yù)開展“溫針灸對大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變作用機(jī)制的研究”,在查閱文獻(xiàn)時發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎造模方法較多,藥物選擇和用量、手術(shù)部位、模型形成時間上眾說紛紜,差別較大,給骨性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究帶來較多問題。目的:本實驗從文獻(xiàn)中挑選出三種造模方法,其中藥物注射法選取文獻(xiàn)報道較多的4%的木瓜蛋白酶溶液、0.03mol/L的L-半胱氨酸溶液按2:1的比例混勻,以0.1mL/kg的量注射膝關(guān)節(jié);手術(shù)法采用文獻(xiàn)報道較多的前交叉韌帶切斷法及膝關(guān)節(jié)以屈曲位持續(xù)制動法。通過對SD大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎三種模型在各個時間段的效果比較,明確各組模型形成骨性關(guān)節(jié)炎的時間,并綜合分析選擇更為理想的動物模型,為下一步溫針灸對大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。方法:將128只SPF級健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為A組空白組、B組制動組、C組木瓜蛋白酶組、D組手術(shù)組,每組32只,各組均以大鼠的右膝建立模型。B組將大鼠膝關(guān)節(jié)以屈曲位持續(xù)制動;C組將4%的木瓜蛋白酶溶液、0.03mol/L的L-半胱氨酸溶液按2:1的比例混勻,以0.1mL/kg的量于實驗的第1、4、7天行右膝關(guān)節(jié)腔注射;D組采用ACLT法即前交叉韌帶切斷術(shù);空白組大鼠只抓取。每天記錄各組大鼠的一般狀態(tài),在實驗開始的2、4、6、8周的最后一天,分四批處理各組大鼠,每組每次8只。進(jìn)行行為學(xué)觀察,對各組大鼠按LequesneMG法進(jìn)行評分;用WAGNER壓痛儀測大鼠痛閾;取大鼠右后肢進(jìn)行影像學(xué)觀察;取大鼠右膝關(guān)節(jié),對軟骨表面進(jìn)行大體觀察評分,HE染色切片并進(jìn)行病理觀察。結(jié)果:1.軟骨大體觀察評分、LequesneMG評分、痛閾各組組內(nèi)比較:(1)A組大鼠整個實驗過程中表現(xiàn)正常,右膝關(guān)節(jié)軟骨表面均光滑、透明,各時間段右膝關(guān)節(jié)均未見腫脹,按壓時未見明顯疼痛反應(yīng),大鼠奔跑時踏地有力、步態(tài)正常,膝關(guān)節(jié)活動范圍正常,整個實驗過程中未見明顯改變。大鼠在2、4、6、8周的痛閾相互比較,均無顯著差異(P0.05),提示空白組未出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn)。(2)B組大鼠軟骨大體觀察評分、LequesneMG評分、痛閾在第2周、4周、6周差異性顯著(P0.05),第8周與第2周、4周比較差異顯著(P0.05),第6周與第8周比較差異不具有顯著性(P0.05)。(3)C組大鼠LequesneMG評分、痛閾在第2周、4周、6周、8周差異性顯著(P0.05);6周與8周軟骨大體觀察評分比較差異不具有顯著性(P0.05),其余兩兩比較差異均顯著(P0.05)。(4)D組大鼠軟骨大體觀察評分、LequesneMG評分、痛閾在第4周、6周時差異性不顯著(P0.05),其余時間段兩兩相比差異均顯著(P0.05)。2.軟骨大體觀察評分、LequesneMG評分、痛閾各組組間比較:(1)組間軟骨大體觀察評分比較:B、C、D組與A組在2、4、6、8周評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0000.05),2、4周時B組評分高于其他兩組,6周時三組評分區(qū)別不大、D組略高,8周時C、D組高于B組。(2)組間Lequesne MG評分比較:B、C、D組與A組在2、4、6、8周評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0000.05),2、4周時D組評分高于其他兩組,6、8周時B組相對較高。(3)組間痛閾的比較:(1)2周后B、C、D組與A組比較,P0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異。C、D組與B組比較,P0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義,C、D組比較,P0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異。(2)4周后B、C、D三組與空白組比較痛閾明顯降低,P0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異。B、C、D組相互比較,P0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義。(3)6周后B、C、D三組與空白組比較痛閾顯著降低,P0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異;B、C組、B、D組比較,P0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義;C、D組比較,P0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異。(4)造模8周后B、C、D三組與空白組比較痛閾顯著降低,P0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異;B、C、D組相互比較,P0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義。3.大鼠膝關(guān)節(jié)正側(cè)位X線片顯示:(1)A組大鼠2、4、6、8周時膝關(guān)節(jié)正側(cè)位片均未見明顯異常。(2)B組大鼠2周時膝關(guān)節(jié)正側(cè)位片均未見明顯異常;4周時,髁間嵴有輕微增生;6周時,髁間嵴及脛骨內(nèi)側(cè)緣增生,關(guān)節(jié)面輪廓粗糙,關(guān)節(jié)間隙略變窄;8周時,關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙不一致、略有變窄,關(guān)節(jié)面不光滑、髁間嵴變尖,關(guān)節(jié)軟骨高密度影。(3)C組大鼠2周時膝關(guān)節(jié)正側(cè)位片均未見明顯異常;4周時,髁間嵴有輕微增生;6周時,髁間嵴及脛骨內(nèi)側(cè)緣增生,關(guān)節(jié)面輪廓不光滑,關(guān)節(jié)間隙略顯變窄;8周時,關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙不一致、有變窄,關(guān)節(jié)面不光整、髁間嵴變尖,關(guān)節(jié)軟骨高密度影。(4)D組大鼠2周時,膝關(guān)節(jié)正側(cè)位片均未見明顯異常;4周時,髁間嵴有輕微增生,關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙一致,未見明顯狹窄,骨性關(guān)節(jié)面較光滑、關(guān)節(jié)面輪廓清晰完整;6周時與4周表現(xiàn)基本一致;8周時,關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙不一致、有變窄,關(guān)節(jié)面不光整、髁間嵴變尖,關(guān)節(jié)軟骨高密度影。4.軟骨組織HE染色結(jié)果:(1)A組2、4、6、8周的HE染色切片均為觀察到異常表現(xiàn),軟骨表層光滑平整,軟骨細(xì)胞數(shù)量正常、分布均勻,排列整齊,層次清晰,無血管侵入,潮線完整,基質(zhì)染色正常。(2)B組2周時,HE染色正常,軟骨表層光滑整齊,軟骨細(xì)胞數(shù)量正常且分布均勻,層次清晰,潮線完整,基質(zhì)染色均勻、無失染;4周時,軟骨表層不平整,無裂隙形成,彌漫性細(xì)胞過多,基質(zhì)染色正�；蜉p染,鏡下見軟骨組織輕微損傷;6周時,鏡下表現(xiàn)為中度損傷,軟骨表層不平整,有裂隙達(dá)過渡帶,細(xì)胞數(shù)目減少、排列不整齊,潮線有殘缺,基質(zhì)輕染;8周時,鏡下觀察為中度損傷,軟骨表面不光滑,有達(dá)放射帶的裂隙,細(xì)胞數(shù)目減少,基質(zhì)輕染,潮線不完整。(3)C組注射木瓜蛋白酶后2周,光鏡下未見明顯異常;4周后,鏡下觀察有輕度損傷,軟骨表層不平整,無裂隙形成,彌漫性細(xì)胞數(shù)量變多、分布不均,層次不清,潮線基本完整,基質(zhì)染色不勻,鏡下見軟骨組織輕微損傷;6周后,鏡下表現(xiàn)為中度損傷,軟骨表層不光滑,細(xì)胞數(shù)目減少、排列不整齊,潮線有殘缺,有血管翳形成,基質(zhì)輕染;8周后,鏡下觀察為中度損傷,軟骨表面不光滑,有達(dá)放射帶的裂隙形成,細(xì)胞數(shù)目減少、排列不整齊,基質(zhì)輕染,潮線不完整。(4)D組前交叉韌帶切斷后2周后,HE染色未見明顯異常;4周后,關(guān)節(jié)軟骨表現(xiàn)為輕微損傷,軟骨表層不光滑,細(xì)胞有簇狀分布,層次尚清晰,基質(zhì)染色不均,潮線尚完整;6周后,表現(xiàn)為輕度損傷,軟骨表層被破壞,細(xì)胞呈簇分布,基質(zhì)輕染,潮線不完整;8周后,表現(xiàn)為中度損傷,軟骨表面不光滑,局部有達(dá)輻射帶的裂隙形成,細(xì)胞分布不均,基質(zhì)染色淺,潮線不完整。結(jié)論:(1)制動法、關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶法、前交叉韌帶切斷法均能成功建立與人類膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎相似的動物模型。(2)制動組大鼠持續(xù)制動4周后表現(xiàn)為早期骨性關(guān)節(jié)炎,6、8周相當(dāng)于人類KOA中期;木瓜蛋白酶組與制動組類似,4周為早期,6、8周出現(xiàn)KOA中期表現(xiàn);手術(shù)組4、6周為KOA早期,8周為中期。(3)關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶法操作簡便,動物生存質(zhì)量相對較高,4周為KOA早期,6、8周為中期,是相對理想的造模方法。
【學(xué)位授予單位】：山西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R684.3;R-332
【圖文】：

大鼠屈曲位制動圖

2018 屆碩士學(xué)位論文6圖 2 大鼠前交叉韌帶切斷術(shù)過程圖2.2.4 空白對照組給予大鼠同其他組大鼠同樣的抓取。處理后，各組大鼠群居、自由活動及進(jìn)食、飲水。2.3 觀察指標(biāo)每天記錄各組大鼠的一般狀態(tài)，在實驗開始的第 2、4、6、8 周的最后一天，分四批處理各組對應(yīng)時間窗口的大鼠。進(jìn)行行為學(xué)觀察，對各組大鼠按改良版 LequesneMG 法[13]（見附錄表 1 所示）進(jìn)行評分；用 WAGNER 壓痛儀測大鼠痛閾；取大鼠右后肢進(jìn)行影像學(xué)觀察；獲取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，對膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行大體觀察評分，HE染色切片并進(jìn)行病理觀察。2.3.1 一般情況觀察及膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察評分仔細(xì)觀察并記錄大鼠的精神狀態(tài)、姿勢、皮毛色澤、活動度、飲水、大便等全身情況。在處死大鼠時，剝離大鼠右膝關(guān)節(jié)外肌肉層，切斷膝關(guān)節(jié)所有韌帶，打開關(guān)節(jié)腔，充分暴露股骨髁和脛骨平臺，觀察關(guān)節(jié)面軟骨顏色、質(zhì)感、形狀和光滑程度。按照以下評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠右膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行大體觀察評分[14]：軟骨表面光滑、透明-0分； 軟骨表面光滑，而有瑕疵-1 分；軟骨表面光滑，為乳白色不透明狀-2 分；軟骨表面不光滑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2742140