【摘要】：目的Hfq與s RNA結(jié)合,它們的結(jié)合體通過s RNA與靶m RNA進(jìn)行配對相互作用,通過該結(jié)合機(jī)制尋找相關(guān)靶m RNA是研究其調(diào)節(jié)功能的主要手段,本文旨在尋找B.p C006中Hfq相關(guān)m RNA,為進(jìn)一步研究m RNA生物學(xué)功能和致病機(jī)制打下基礎(chǔ)。方法1)PCR擴(kuò)增B.p C006菌株的Hfq基因并亞克隆至p MD19-T克隆載體中,經(jīng)測序驗(yàn)證后,用Ndel和Xhol雙酶切p MD19T-Hfq與p ET30a(+),然后插入目的基因以構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p ET30a(+)-Hfq。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21(DE3),以IPTG最佳劑量濃度誘導(dǎo)目的基因表達(dá),提取其表達(dá)產(chǎn)物利用SDS-PAGE與Western blot分析鑒定,確定目的蛋白,最后經(jīng)過Ni2+螯合柱純化表達(dá)產(chǎn)物以取得目的蛋白;2)將前期實(shí)驗(yàn)得到的重組表達(dá)質(zhì)粒p ET30a(+)-Hfq轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌S17中,隨后挑取陽性單克隆以做菌液PCR驗(yàn)證,利用重組質(zhì)粒S17/p ET30a(+)-Hfq接合入B.p C006,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白Hfq表達(dá),將細(xì)菌破碎提取上清,并利用His-tag單抗通過免疫共沉淀方法分離Hfq與其結(jié)合的RNA,利用TRIzol Universal提取RISC復(fù)合物中的RNA,采用Nano drop測所得RNA的濃度,取出部分RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),其余逆轉(zhuǎn)錄為c DNA放液氮速凍并保存以后續(xù)送高通量測序并構(gòu)建m RNA子文庫。結(jié)果1)以臨床B.p C006菌株DNA為模板,利用PCR擴(kuò)增,其結(jié)果與Hfq基因理論值預(yù)期大小的片段一致;2)經(jīng)雙酶切和測序驗(yàn)證亞克隆質(zhì)粒與原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;3)利用IPTG最佳劑量濃度誘導(dǎo)大腸埃希菌BL21(DE3)中的His-Hfq的融合蛋白,蛋白電泳顯示約9.4k Da;4)通過His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒及Western blot分析鑒定獲得單一條帶的目的蛋白;5)重組質(zhì)粒S17/p ET30a(+)-Hfq接合入B.p C006后經(jīng)PCR驗(yàn)證得到陽性單克隆;6)利用His-tag單抗體通過免疫共沉淀方法分離得到與Hfq結(jié)合的相關(guān)RNA;7)高通量測序構(gòu)建Hfq相關(guān)m RNA子文庫,總共檢測到的基因數(shù)目有4185個,其中檢測到的已知基因數(shù)目有4155個,檢測到的新基因數(shù)目有30個。新基因中運(yùn)用KEGG Pathway分析及預(yù)測發(fā)現(xiàn)有5個基因都可以在KEGG-A-class與KEGG-B-class信號通路中找到,預(yù)測其可能有新陳代謝、環(huán)境信息加工、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝及其他次生代謝的生物合成功能;8)附加發(fā)現(xiàn)9個Hfq相關(guān)s RNA。結(jié)論1)原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;2)在大腸埃希菌中His-Hfq融合蛋白成功表達(dá),并經(jīng)過Ni2+柱純化得到了s RNA伴侶蛋白Hfq;3)Hfq相關(guān)m RNA文庫被成功構(gòu)建且進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析、多態(tài)性、插入突變、RNA基因編輯及基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等,為進(jìn)一步鉆研這些m RNA的功能提供了根底,研究B.P的m RNA功能可能會揭示B.P某方面的致病機(jī)制,從而找到相應(yīng)的治療靶點(diǎn);4)附加發(fā)現(xiàn)9個Hfq相關(guān)s RNA,同時為篩選與該蛋白相關(guān)生物s RNA奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R378
【圖文】：

將柱子從化從新放回收集離心管。7 向吸附柱中加入 600μLWash Solution，12000rpm 離心 30sec。棄掉廢液，將柱子從化從新放回收集離心管。重復(fù)步驟 7。8 將上述空吸附柱從新放入收集離心管中，放入低溫離心機(jī)，高速離心3min，丟掉離心管，重用新離心管。9 用中號移液器在吸附膜中央加入 30μLElution Buffer，室溫?cái)R置 4min，高速離心 1min。將通過上述膠回收并純化過程得到的 DNA 溶液測濃度及純度后標(biāo)記好并置-20℃保存或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒 pET30a（+）-Hfq 的構(gòu)建及鑒定將純化的 PCR 產(chǎn)物與 pMD19- T 載體（圖 1-1）進(jìn)行 T-A 克隆，并轉(zhuǎn)化，隨后將轉(zhuǎn)化菌涂鋪在含 100mg.L－１Amp（氨芐霉素）的 LB 固體培育營養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。次日挑其單克隆經(jīng) PCR 驗(yàn)證并經(jīng)測序驗(yàn)證（華大基因），BLAST 分析測序結(jié)果，最終確認(rèn)獲得 pMD19T- Hfq 亞克隆載體。

圖 1-2 原核表達(dá)載體 pET30a（+）的酶切位點(diǎn)Fig.1-2 Prokaryotic expression vector pET30a(+) restriction site（1）10μL 亞克隆反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：22℃，30min。試劑 體積（μL）pMD19-TVector（50ng/μL）1.0PCR 純化產(chǎn)物 1.0Solution I 8.0按前述方法提取質(zhì)粒 pM D19T-Hfq 與 pET30a（+），用 Ndel 和 Xhol 分別雙酶切 pM D19T-Hfq 與 pET30a（+）質(zhì)粒（圖 1-2），按步驟回收與純化Hfq 基因，并將 Hfq 基因連接到原核表達(dá)載體 pET30a(+)的 Ndel 和 Xhol 酶切

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本文編號：2740741