【摘要】：背景:Wnt信號通路是一類由分泌型糖脂蛋白Wnt介導的信號轉導途徑,在胚胎發(fā)育以及成體組織穩(wěn)態(tài)的維持過程中參與調控細胞的增殖、極性、死亡,從而決定細胞的命運。由于該信號通路在胚胎的背腹體軸的建立、組織和器官的形成進程中發(fā)揮著至關重要的作用,因此,深入研究Wnt信號通路的分子調控機理,對于充分了解組織或器官的發(fā)育過程以及相關疾病的發(fā)病機制具有重要的理論和實踐意義。經典Wnt信號途徑主要通過β-catenin的核易位來實現對靶基因的轉錄活性的激活,因此經典Wnt信號通路又被稱為Wnt/β-catenin信號通路。當細胞沒有接收Wnt信號時,胞質內的β-catenin被由支架蛋白Axin、腺瘤性息肉病基因蛋白產物(adenomatouspolyposiscoli gene product,APC)、酪蛋白激酶 1(casein kinase 1,CK1)以及糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK3)等組成的蛋白降解復合體招募。首先由CK1磷酸化β-catenin的Ser45位點,進而促進GSK3依次對β-catenin的Thr41、Ser37以及Ser33位點的磷酸化;磷酸化的β-catenin能夠被E3泛素連接酶亞基—β-轉導序列包含蛋白(β-transducin repeats containing proteins,β-Trcp)識別并結合,最終導致β-catenin泛素化并經蛋白酶體途徑降解,故β-catenin無法進入細胞核激活靶基因的轉錄。而當Wnt配體與其受體Frizzled(FZD)以及低密度脂蛋白受體相關蛋白 5/6(low-density lipoprotein receptor-related proteins 5/6,LRP5/6)共受體復合物結合時,Axin被LRP5/6的胞內端招募進而移位至細胞膜,促使Axin/APC/CK1/GSK3復合體解離。β-catenin逃離了被磷酸化后降解的命運,在細胞漿中累積并入核,結合轉錄因子T細胞因子1,3,4/淋巴增強子因子 1(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF1,3,4/LEF1),促進靶基因的轉錄和表達。值得注意的是,作為經典Wnt信號靶基因之一的分泌型靶蛋白Dickkopf 1(Dkk1),能夠競爭性地結合到共受體LRP5/6上,從而破壞了 LRP5/6與Wnt配體的結合,從而以負反饋的方式抑制了經典Wnt信號。由此可見,β-catenin在細胞漿中穩(wěn)定并累積是經典Wnt信號途徑轉導過程中的關鍵分子事件之一。然而,影響胞漿中β-catenin穩(wěn)定性的因素眾多,但相關研究仍較少且尚無定論。Rho蛋白作為小分子的鳥苷酸結合蛋白,又被稱為小G蛋白(Rho small GTPase),該家族主要成員包括RhoA、Rac1以及Cdc42,它們借助鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide-exchange factors,GEFs)和 GTP 酶活化蛋白(GTPase-activating proteins,GAPs)實現活性形式(Rho-GTP-bound)和非活性形式(Rho-GDP-bound)之間的轉換,從而作為一種“分子開關(molecular switches)”調節(jié)許多重要的信號轉導途徑,進而調控細胞的增殖、凋亡、分化以及細胞骨架重排和細胞遷移等。已有研究報道在經典Wnt信號通路中,Rac1的激活是β-catenin分子入核的必要條件,并且在基因水平上Rac1通過與β-catenin以及Dkk1相互作用,在胚胎期調控小鼠胚胎肢芽的發(fā)育。然而,RhoA或者Cdc42是否具有通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號而發(fā)揮調控小鼠四肢的發(fā)育的功能尚未見研究報道。目的:1.采用體外細胞學實驗方法,探究RhoA是否具有調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路的作用;2.探究RhoA參與調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路的具體分子機制;3.利用基因修飾小鼠明確RhoA在調控小鼠四肢發(fā)育過程中的功能。方法:1.首先在體外細胞學上(小鼠胚胎成纖維細胞,C3H10T1/2細胞系),利用GST-pull down 明確 Wnt3a 重組蛋白(recombinant Wnt3a,rWnt3a)是否能夠激活RhoA,并且通過Western blot探究Wnt3a激活RhoA的分子機制,從而確證RhoA是否是經典Wnt信號通路中的成員而且受Wnt所調控;2.利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)敲降RhoA或其效應激酶—Rho相關激酶(Rho-associated kinase,ROCK),以及過表達持續(xù)激活形式的RhoA(consitutively activated RhoA,caRhoA)或 ROCK2(caROCK2),探究RhoA/ROCK對于rWnt3a所誘導的Lef1熒光素酶報告基因(Lef1-luciferase reporter)活性的影響,從而明確RhoA/ROCK是否能夠調節(jié)經典Wnt信號;3.通過核質分離以及免疫熒光的方法,明確RhoA/ROCK對于β-catenin水平以及核質分布的調控,進一步確證RhoA/ROCK對Wnt/β-catenin信號通路的影響;4.采用Western blot、熒光素酶報告基因以及免疫熒光等方法,進一步探究RhoA/ROCK影響β-catenin水平以及核質分布的分子機制;.5.構建小鼠頂端外胚層脊(apical ectodermal ridge,AER)部位特異性(Msx2-Cre)的 RhoA 功能缺失(loss-of-function,Msx2-Cre;CT-dnRhoA+/-和Msx2-Cre;RhoAf/f)以及功能獲得(gain-of-function,Msx2-Cre;caRhoA+/-)的基因修飾小鼠,取E16.5天的上述各基因型胎鼠,利用骨骼染色分析小鼠四肢表型;同時繁殖經典Wnt信號缺失時的上述各基因型小鼠(即:Msx2-Cre;Dkk1+/+;CAT-dnRhoA+/-,Msx2-Cre;Dkk1+/+;RhoAf/f 以及 Msx2-Cre;Dkk1+/+;caRhoA+/-),比較分析小鼠四肢表型;此外,繁殖β-catenin缺失同時抑制RhoA的小鼠(Msx2-Cre;β-cateninf/f CAT-dnRhoA+/-),觀察并分析表型;6.取E10.5胎鼠的前肢肢芽,利用原位雜交、石蠟切片Tunel染色等方法,探究RhoA的激活或缺失對AER部位纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor 8,FGF8)以及骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogenetic protein 4,BMP4)mRNA水平的影響以及細胞凋亡、磷酸化β-catenin等蛋白表達水平。結果:1.在C3H10T1/2細胞株上,1)rWnt3a能夠時間和劑量依賴性地激活RhoA,并且這種激活作用可以被Dkk1重組蛋白(recombinant Dkk1,rDkk1)所抑制;2)并且在人胚腎上皮細胞(HEK293T)、小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3、L929)等細胞株上,Wnt3a同樣可以激活RhoA;3)Wnt3a通過FZD/Gαq/Dv1/Daam1信號途徑激活RhoA;2.在C3H10T1/2細胞株上敲降RhoA或ROCK1/2以及利用ROCK的抑制劑Y27632均能夠協同性地上調Wnt3a所誘導的Lef1熒光素酶報告基因的活性(p0.01);而激活RhoA或ROCK2則下調Wnt3a所誘導的Lef1熒光素酶報告基因的活性(p0.01);3.核質分離或免疫熒光結果顯示:在C3H10T1/2細胞株上敲降RhoA或利用ROCK的抑制劑Y27632,均能夠顯著上調β-catenin的總蛋白水平以及細胞核、細胞漿中的β-catenin蛋白水平;而過表達caRhoA或caROCK2則顯著下調β-catenin的總蛋白水平以及細胞核、細胞漿中的β-catenin蛋白水平;4.Western blot結果顯示:1)Wnt3a可以通過RhoA/ROCK激活Janus激酶1/2,(Januskinase1/2,JAK1/2);2)JAK1/2 直接磷酸化 GSK3β的 Tyr216 位點,從而激活 GSK3β;3)活化的 GSK3β磷酸化β-catenin 的 Thr41、Ser37、Ser31位點,從而導致β-catenin降解;5.E16.5天胎鼠骨骼染色結果顯示:1)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+基因型小鼠呈現出典型的經典Wnt信號缺失的表型,即后肢缺失,前肢不同程度截短;2)而Msx2-Cre;CAT-dnRhoA+/-基因型小鼠無明顯發(fā)育缺陷,而當過表達Dkk1的同時抑制RhoA(Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+;CAT-dnRhoA+/-),則能夠顯著挽救由于經典Wnt信號缺失導致的四肢發(fā)育缺陷,即前肢完全被挽救,且后肢也在很大程度上得到挽救;3)類似的,過表達Dkk1的同時缺失RhoA(Msx2-Cre;Dkk1+/+;RhoAf/f)的小鼠有著相似的挽救表型;4)另一方面,過表達Dkk 的同時激活RhoA(Msx2-Cre;R26-Dkk1+/-;caRhoA+/-),則不能夠挽救四肢發(fā)育的缺陷;5)此外,缺失β-catenin的同時抑制RhoA(Msx2-Cre;β-cateninn/f;CAT-dnRhoA+/-)也不能夠挽救經典Wnt信號缺失(Msx2-Cre;β-cateninn/f)導致的四肢發(fā)育缺陷;6.原位雜交結果顯示:與對照小鼠(Msx2-Cre)相比,1)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+基因型小鼠FGF8和BMP4的mRNA表達水平顯著下降;2)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+;CAT-dnRhoA+/-基因型小鼠,上述兩種基因表達水平得到挽救;3)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/-;caRhoA+/-基因型小鼠,上述兩種基因表達水平不能得到挽救;4)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+基因型小鼠AER部位細胞凋亡顯著增加,磷酸化β-catenin水平顯著增加,β-catenin總量顯著下降;5)Msx2-Cre;caRhoA+/-基因型小鼠,AER部位磷酸化JAK2、磷酸化GSK3β以及磷酸化β-catenin水平顯著增加,β-catenin總量顯著下降;6)Msx2-Cre;CAT-dnRhoA+/-基因型小鼠,AER部位磷酸化JAK2、磷酸化GSK3β以及磷酸化β-catenin水平顯著下降,而β-catenin總量顯著增加且入核顯著增多。結論:1.Wnt 通過 FZD/Gαq/Dv1/Daam1 信號途徑激活 RhoA;2.RhoA通過ROCK/JAK/GSK3β(Tyr216)信號途徑磷酸化β-catenin,進而導致β-catenin降解,從而負向調節(jié)經典Wnt信號;3.在AER部位RhoA與Dkk1相互作用調節(jié)小鼠胚胎肢芽發(fā)育。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R363
【圖文】：

圖２．３．４．１ｐＳｉｃｏＲ干擾載體圖譜逡逑２．３．４．２慢病毒包裝逡逑（１）細胞轉染：消化ＨＥＫ２９３Ｔ細胞后進行計數，按照ｌｘ１0６個／ｍｌ的細胞接種到１５邋ｃｍ細胞培養(yǎng)皿中，待細胞融合度達９０％以上時進行細胞轉染病毒包裝質粒轉染按照如下比例進行：目的基因的ｓｈＲＮＡ邋（對照病毒轉染ｐＳｉｃｏＲ）：ｐＭＤＬ：ｐＲｅｖ：ｐＶＳＶＧ＝２：ｌ：ｌ：ｌ，每個１５ｃｍ的細胞培養(yǎng)皿共轉染５０｜ｉｇ。轉染操作步驟參照２．３．３．２質粒轉染操作方法進行；逡逑（２）病毒包裝：轉染后６邋ｈ，將培養(yǎng)基換成不含雙抗的ＤＭＥＭ高糖培養(yǎng)１０％ＦＢＳ）繼續(xù)培養(yǎng)４８ｈ，收集第一批培養(yǎng)上清；再換入新鮮的不含雙抗的Ｄ高糖培養(yǎng)基（含１０％ＦＢＳ邋）繼續(xù)培養(yǎng)２４邋ｈ，收集第二批培養(yǎng)上清；逡逑（３）將兩批培養(yǎng)上清混合，常溫ｌＯＯＯｒｐｍ轉速離心１０邋ｍｉｎ，取上清，

浙江大學博士學位論文邐材料和方法逡逑因組沉淀），溶于２００邋ｐｌｄｄＨ２０中，５５邋°Ｃ雜交爐中繼續(xù)孵育過夜，而后即逡逑得小鼠基因組，可用于基因型鑒定。逡逑２．３．１３．２偷Ｊ條件性敲除小鼠的構建逡逑（１邋）委托南京大學模式動物研究所利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術構建條件性逡逑局支除小鼠；逡逑（２）敲除策略如圖２．３．１３．２所示；逡逑ＲｈｏＡ邋＼ｏｃｒｎ逡逑

【參考文獻】

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1 Kevin A.Maupin;Casey J.Droscha;Bart O.Williams;;A Comprehensive Overview of Skeletal Phenotypes Associated with Alterations in Wnt/β-catenin Signaling in Humans and Mice[J];Bone Research;2013年01期

本文編號：2740688