【摘要】：背景:Wnt信號(hào)通路是一類由分泌型糖脂蛋白Wnt介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在胚胎發(fā)育以及成體組織穩(wěn)態(tài)的維持過(guò)程中參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、極性、死亡,從而決定細(xì)胞的命運(yùn)。由于該信號(hào)通路在胚胎的背腹體軸的建立、組織和器官的形成進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,因此,深入研究Wnt信號(hào)通路的分子調(diào)控機(jī)理,對(duì)于充分了解組織或器官的發(fā)育過(guò)程以及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑主要通過(guò)β-catenin的核易位來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性的激活,因此經(jīng)典Wnt信號(hào)通路又被稱為Wnt/β-catenin信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞沒有接收Wnt信號(hào)時(shí),胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin被由支架蛋白Axin、腺瘤性息肉病基因蛋白產(chǎn)物(adenomatouspolyposiscoli gene product,APC)、酪蛋白激酶 1(casein kinase 1,CK1)以及糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK3)等組成的蛋白降解復(fù)合體招募。首先由CK1磷酸化β-catenin的Ser45位點(diǎn),進(jìn)而促進(jìn)GSK3依次對(duì)β-catenin的Thr41、Ser37以及Ser33位點(diǎn)的磷酸化;磷酸化的β-catenin能夠被E3泛素連接酶亞基—β-轉(zhuǎn)導(dǎo)序列包含蛋白(β-transducin repeats containing proteins,β-Trcp)識(shí)別并結(jié)合,最終導(dǎo)致β-catenin泛素化并經(jīng)蛋白酶體途徑降解,故β-catenin無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)Wnt配體與其受體Frizzled(FZD)以及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 5/6(low-density lipoprotein receptor-related proteins 5/6,LRP5/6)共受體復(fù)合物結(jié)合時(shí),Axin被LRP5/6的胞內(nèi)端招募進(jìn)而移位至細(xì)胞膜,促使Axin/APC/CK1/GSK3復(fù)合體解離。β-catenin逃離了被磷酸化后降解的命運(yùn),在細(xì)胞漿中累積并入核,結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子1,3,4/淋巴增強(qiáng)子因子 1(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF1,3,4/LEF1),促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。值得注意的是,作為經(jīng)典Wnt信號(hào)靶基因之一的分泌型靶蛋白Dickkopf 1(Dkk1),能夠競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到共受體LRP5/6上,從而破壞了 LRP5/6與Wnt配體的結(jié)合,從而以負(fù)反饋的方式抑制了經(jīng)典Wnt信號(hào)。由此可見,β-catenin在細(xì)胞漿中穩(wěn)定并累積是經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵分子事件之一。然而,影響胞漿中β-catenin穩(wěn)定性的因素眾多,但相關(guān)研究仍較少且尚無(wú)定論。Rho蛋白作為小分子的鳥苷酸結(jié)合蛋白,又被稱為小G蛋白(Rho small GTPase),該家族主要成員包括RhoA、Rac1以及Cdc42,它們借助鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide-exchange factors,GEFs)和 GTP 酶活化蛋白(GTPase-activating proteins,GAPs)實(shí)現(xiàn)活性形式(Rho-GTP-bound)和非活性形式(Rho-GDP-bound)之間的轉(zhuǎn)換,從而作為一種“分子開關(guān)(molecular switches)”調(diào)節(jié)許多重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化以及細(xì)胞骨架重排和細(xì)胞遷移等。已有研究報(bào)道在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中,Rac1的激活是β-catenin分子入核的必要條件,并且在基因水平上Rac1通過(guò)與β-catenin以及Dkk1相互作用,在胚胎期調(diào)控小鼠胚胎肢芽的發(fā)育。然而,RhoA或者Cdc42是否具有通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)而發(fā)揮調(diào)控小鼠四肢的發(fā)育的功能尚未見研究報(bào)道。目的:1.采用體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,探究RhoA是否具有調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用;2.探究RhoA參與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的具體分子機(jī)制;3.利用基因修飾小鼠明確RhoA在調(diào)控小鼠四肢發(fā)育過(guò)程中的功能。方法:1.首先在體外細(xì)胞學(xué)上(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,C3H10T1/2細(xì)胞系),利用GST-pull down 明確 Wnt3a 重組蛋白(recombinant Wnt3a,rWnt3a)是否能夠激活RhoA,并且通過(guò)Western blot探究Wnt3a激活RhoA的分子機(jī)制,從而確證RhoA是否是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的成員而且受Wnt所調(diào)控;2.利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)敲降RhoA或其效應(yīng)激酶—Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase,ROCK),以及過(guò)表達(dá)持續(xù)激活形式的RhoA(consitutively activated RhoA,caRhoA)或 ROCK2(caROCK2),探究RhoA/ROCK對(duì)于rWnt3a所誘導(dǎo)的Lef1熒光素酶報(bào)告基因(Lef1-luciferase reporter)活性的影響,從而明確RhoA/ROCK是否能夠調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào);3.通過(guò)核質(zhì)分離以及免疫熒光的方法,明確RhoA/ROCK對(duì)于β-catenin水平以及核質(zhì)分布的調(diào)控,進(jìn)一步確證RhoA/ROCK對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響;4.采用Western blot、熒光素酶報(bào)告基因以及免疫熒光等方法,進(jìn)一步探究RhoA/ROCK影響β-catenin水平以及核質(zhì)分布的分子機(jī)制;.5.構(gòu)建小鼠頂端外胚層脊(apical ectodermal ridge,AER)部位特異性(Msx2-Cre)的 RhoA 功能缺失(loss-of-function,Msx2-Cre;CT-dnRhoA+/-和Msx2-Cre;RhoAf/f)以及功能獲得(gain-of-function,Msx2-Cre;caRhoA+/-)的基因修飾小鼠,取E16.5天的上述各基因型胎鼠,利用骨骼染色分析小鼠四肢表型;同時(shí)繁殖經(jīng)典Wnt信號(hào)缺失時(shí)的上述各基因型小鼠(即:Msx2-Cre;Dkk1+/+;CAT-dnRhoA+/-,Msx2-Cre;Dkk1+/+;RhoAf/f 以及 Msx2-Cre;Dkk1+/+;caRhoA+/-),比較分析小鼠四肢表型;此外,繁殖β-catenin缺失同時(shí)抑制RhoA的小鼠(Msx2-Cre;β-cateninf/f CAT-dnRhoA+/-),觀察并分析表型;6.取E10.5胎鼠的前肢肢芽,利用原位雜交、石蠟切片Tunel染色等方法,探究RhoA的激活或缺失對(duì)AER部位纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor 8,FGF8)以及骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogenetic protein 4,BMP4)mRNA水平的影響以及細(xì)胞凋亡、磷酸化β-catenin等蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.在C3H10T1/2細(xì)胞株上,1)rWnt3a能夠時(shí)間和劑量依賴性地激活RhoA,并且這種激活作用可以被Dkk1重組蛋白(recombinant Dkk1,rDkk1)所抑制;2)并且在人胚腎上皮細(xì)胞(HEK293T)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3、L929)等細(xì)胞株上,Wnt3a同樣可以激活RhoA;3)Wnt3a通過(guò)FZD/Gαq/Dv1/Daam1信號(hào)途徑激活RhoA;2.在C3H10T1/2細(xì)胞株上敲降RhoA或ROCK1/2以及利用ROCK的抑制劑Y27632均能夠協(xié)同性地上調(diào)Wnt3a所誘導(dǎo)的Lef1熒光素酶報(bào)告基因的活性(p0.01);而激活RhoA或ROCK2則下調(diào)Wnt3a所誘導(dǎo)的Lef1熒光素酶報(bào)告基因的活性(p0.01);3.核質(zhì)分離或免疫熒光結(jié)果顯示:在C3H10T1/2細(xì)胞株上敲降RhoA或利用ROCK的抑制劑Y27632,均能夠顯著上調(diào)β-catenin的總蛋白水平以及細(xì)胞核、細(xì)胞漿中的β-catenin蛋白水平;而過(guò)表達(dá)caRhoA或caROCK2則顯著下調(diào)β-catenin的總蛋白水平以及細(xì)胞核、細(xì)胞漿中的β-catenin蛋白水平;4.Western blot結(jié)果顯示:1)Wnt3a可以通過(guò)RhoA/ROCK激活Janus激酶1/2,(Januskinase1/2,JAK1/2);2)JAK1/2 直接磷酸化 GSK3β的 Tyr216 位點(diǎn),從而激活 GSK3β;3)活化的 GSK3β磷酸化β-catenin 的 Thr41、Ser37、Ser31位點(diǎn),從而導(dǎo)致β-catenin降解;5.E16.5天胎鼠骨骼染色結(jié)果顯示:1)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+基因型小鼠呈現(xiàn)出典型的經(jīng)典Wnt信號(hào)缺失的表型,即后肢缺失,前肢不同程度截短;2)而Msx2-Cre;CAT-dnRhoA+/-基因型小鼠無(wú)明顯發(fā)育缺陷,而當(dāng)過(guò)表達(dá)Dkk1的同時(shí)抑制RhoA(Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+;CAT-dnRhoA+/-),則能夠顯著挽救由于經(jīng)典Wnt信號(hào)缺失導(dǎo)致的四肢發(fā)育缺陷,即前肢完全被挽救,且后肢也在很大程度上得到挽救;3)類似的,過(guò)表達(dá)Dkk1的同時(shí)缺失RhoA(Msx2-Cre;Dkk1+/+;RhoAf/f)的小鼠有著相似的挽救表型;4)另一方面,過(guò)表達(dá)Dkk 的同時(shí)激活RhoA(Msx2-Cre;R26-Dkk1+/-;caRhoA+/-),則不能夠挽救四肢發(fā)育的缺陷;5)此外,缺失β-catenin的同時(shí)抑制RhoA(Msx2-Cre;β-cateninn/f;CAT-dnRhoA+/-)也不能夠挽救經(jīng)典Wnt信號(hào)缺失(Msx2-Cre;β-cateninn/f)導(dǎo)致的四肢發(fā)育缺陷;6.原位雜交結(jié)果顯示:與對(duì)照小鼠(Msx2-Cre)相比,1)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+基因型小鼠FGF8和BMP4的mRNA表達(dá)水平顯著下降;2)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+;CAT-dnRhoA+/-基因型小鼠,上述兩種基因表達(dá)水平得到挽救;3)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/-;caRhoA+/-基因型小鼠,上述兩種基因表達(dá)水平不能得到挽救;4)Msx2-Cre;R26-Dkk1+/+基因型小鼠AER部位細(xì)胞凋亡顯著增加,磷酸化β-catenin水平顯著增加,β-catenin總量顯著下降;5)Msx2-Cre;caRhoA+/-基因型小鼠,AER部位磷酸化JAK2、磷酸化GSK3β以及磷酸化β-catenin水平顯著增加,β-catenin總量顯著下降;6)Msx2-Cre;CAT-dnRhoA+/-基因型小鼠,AER部位磷酸化JAK2、磷酸化GSK3β以及磷酸化β-catenin水平顯著下降,而β-catenin總量顯著增加且入核顯著增多。結(jié)論:1.Wnt 通過(guò) FZD/Gαq/Dv1/Daam1 信號(hào)途徑激活 RhoA;2.RhoA通過(guò)ROCK/JAK/GSK3β(Tyr216)信號(hào)途徑磷酸化β-catenin,進(jìn)而導(dǎo)致β-catenin降解,從而負(fù)向調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào);3.在AER部位RhoA與Dkk1相互作用調(diào)節(jié)小鼠胚胎肢芽發(fā)育。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R363
【圖文】：

圖２．３．４．１ｐＳｉｃｏＲ干擾載體圖譜逡逑２．３．４．２慢病毒包裝逡逑（１）細(xì)胞轉(zhuǎn)染：消化ＨＥＫ２９３Ｔ細(xì)胞后進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照ｌｘ１0６個(gè)／ｍｌ的細(xì)胞接種到１５邋ｃｍ細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)９０％以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照如下比例進(jìn)行：目的基因的ｓｈＲＮＡ邋（對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染ｐＳｉｃｏＲ）：ｐＭＤＬ：ｐＲｅｖ：ｐＶＳＶＧ＝２：ｌ：ｌ：ｌ，每個(gè)１５ｃｍ的細(xì)胞培養(yǎng)皿共轉(zhuǎn)染５０｜ｉｇ。轉(zhuǎn)染操作步驟參照２．３．３．２質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作方法進(jìn)行；逡逑（２）病毒包裝：轉(zhuǎn)染后６邋ｈ，將培養(yǎng)基換成不含雙抗的ＤＭＥＭ高糖培養(yǎng)１０％ＦＢＳ）繼續(xù)培養(yǎng)４８ｈ，收集第一批培養(yǎng)上清；再換入新鮮的不含雙抗的Ｄ高糖培養(yǎng)基（含１０％ＦＢＳ邋）繼續(xù)培養(yǎng)２４邋ｈ，收集第二批培養(yǎng)上清；逡逑（３）將兩批培養(yǎng)上清混合，常溫ｌＯＯＯｒｐｍ轉(zhuǎn)速離心１０邋ｍｉｎ，取上清，

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文邐材料和方法逡逑因組沉淀），溶于２００邋ｐｌｄｄＨ２０中，５５邋°Ｃ雜交爐中繼續(xù)孵育過(guò)夜，而后即逡逑得小鼠基因組，可用于基因型鑒定。逡逑２．３．１３．２偷Ｊ條件性敲除小鼠的構(gòu)建逡逑（１邋）委托南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術(shù)構(gòu)建條件性逡逑局支除小鼠；逡逑（２）敲除策略如圖２．３．１３．２所示；逡逑ＲｈｏＡ邋＼ｏｃｒｎ逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Kevin A.Maupin;Casey J.Droscha;Bart O.Williams;;A Comprehensive Overview of Skeletal Phenotypes Associated with Alterations in Wnt/β-catenin Signaling in Humans and Mice[J];Bone Research;2013年01期

本文編號(hào)：2740688