【摘要】：目的:探討間隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)在慢性砷誘導上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)中的作用及可能的分子機制。方法:1.BEAS-2B的處理采用0.25μM的亞砷酸鈉持續(xù)作用永生化正常人肺支氣管上皮細胞BEAS-2B45天,即為慢性砷暴露;慢性砷暴露BEAS-2B細胞及由軟瓊脂克隆形成實驗獲得的轉化BEAS-2B細胞為實驗所保存。2.Western Blot檢測正常BEAS-2B、慢性砷誘導45天BEAS-2B和轉化BEAS-2B三種不同細胞中的Cx43表達水平。3.構建Cx43過表達細胞系和Cx43敲減細胞系將Cx43過表達載體(pDsRed-Express-C1-Cx43)轉染正常、轉化BEAS-2B細胞,Cx43干擾質粒(pGPU6/RFP/Neo-Cx43)轉染正常BEAS-2B細胞,加G418篩選14天,挑取單克隆培養(yǎng)從而獲得Cx43過表達細胞系和Cx43敲減細胞系。4.軟瓊脂克隆形成實驗檢測Cx43過表達以及敲減后,不同BEAS-2B細胞克隆形成能力的變化。5.細胞劃痕實驗檢測正常BEAS-2B細胞和轉化BEAS-2B細胞過表達Cx43前后細胞遷移能力的改變。6.Western Blot檢測Cx43過表達和敲減后上皮細胞標志蛋白E-Cadherin、間質細胞標志蛋白Vimentin、MEK、ERK1/2和p-ERK1/2表達水平。7.用MEK抑制劑U0126阻斷MEK/ERK1/2信號通路后,觀察EMT相關標志物、MEK/ERK1/2信號通路相關信號分子表達水平的變化。8.統(tǒng)計學方法所有實驗結果均采用SPSS23.0軟件進行分析。所有數據均采用X±SD進行比較。兩組之間計量資料比較采用t檢驗,多組之間用ANOVA分析,P0.05認為有統(tǒng)計學意義,所有統(tǒng)計圖均采用GraphPad Prism6軟件進行繪制。結果:1.成功轉染pDsRed-Express-C1-Cx43和PGPU6/RFP/Neo-Cx43 BEAS-2B細胞,獲得Cx43過表達細胞系和Cx43敲減細胞系。2.軟瓊脂克隆形成實驗結果表明Cx43過表達及敲減均能影響細胞克隆形成率。在各組細胞克隆形成率的比較中,可見Cx43轉染轉化BEAS-2B組(3.01±0.20%)明顯低于轉化BEAS-2B組(10.22±0.41%),Cx43敲減組(正常BEAS-2B細胞敲減Cx43,4.03±1.04%)高于正常BEAS-2B組(2.50±1.01%),且轉化BEAS-2B組顯著高于正常BEAS-2B組。結果表明Cx43能夠抑制細胞克隆形成率。3.細胞劃痕實驗表明Cx43過表達能夠抑制轉化BEAS-2B細胞的遷移能力。體現在12h和24h轉化BEAS-2B組細胞遷移距離(24.05±3.02,59.06±2.01)明顯大于正常BEAS-2B組(6.07±1.56,27.66±4.06),且Cx43轉染轉化BEAS-2B組(20.15±2.86,52.04±1.89)較轉化BEAS-2B組遷移距離(24.05±3.02,59.06±2.01)明顯縮短。4.Western Blot實驗檢測EMT標志物表明:上皮標志蛋白E-Cadherin的表達與Cx43正相關,間質標志蛋白Vimentin的表達與Cx43負相關。結果發(fā)現,Cx43轉染轉化BEAS-2B組E-Cadherin表達水平(0.73±0.08)較轉化BEAS-2B組(0.30±0.08)升高,而Vimentin表達水平下降(0.48±0.24,2.41±0.21);Cx43敲減組E-Cadherin(0.18±0.01)較正常BEAS-2B組(1.17±0.19)下降,而Vimentin表達水平(1.58±0.13,1.05±0.10)上升。5.Western Blot實驗檢測信號通路相關分子蛋白及EMT標志物表達水平,結果顯示:5.1過表達和敲減Cx43,MEK和ERK1/2的表達均無明顯變化(P0.05),但p-ERK1/2在各組細胞中的表達發(fā)生了變化,即Cx43過表達各組p-ERK1/2表達水平均低于其對照組(P0.05),而Cx43敲減組p-ERK1/2表達水平高于正常BEAS-2B組(P0.05),表明Cx43能夠影響ERK1/2的磷酸化。5.2加入MEK抑制劑U0126后,ERK1/2磷酸化水平在一定程度上受到抑制。同時檢測EMT標志物可見E-Cadherin表達水平較抑制前均有升高(P0.05),且Cx43過表達組較其對照組升高水平更明顯(P0.05);而Vimentin表達水平較抑制前降低(P0.05),且Cx43過表達組較其對照組降低水平更顯著(P0.05),因此說明Cx43能促進E-Cadherin的表達,抑制Vimentin的表達。結論:1.間隙連接蛋白Cx43能夠抑制慢性砷誘導的人肺支氣管上皮細胞克隆形成能力和細胞遷移能力。2.間隙連接蛋白Cx43能促進E-cadherin的表達,抑制Vimentin的表達。3.間隙連接蛋白Cx43可能通過MEK/ERK1/2信號通路抑制砷誘導的人肺支氣管上皮細胞間質轉化。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R363
【圖文】：

學分析驗結果均采用 SPSS23.0 軟件進行分析。所有數據均采用之間計量資料比較采用 t 檢驗，多組之間用 ANOVA 分析意義，所有統(tǒng)計圖均采用 GraphPad Prism6 軟件進行繪制果砷酸鈉處理對 BEAS-2B 細胞的影響 的亞砷酸鈉作用于正常 BEAS-2B 細胞 45 天后，通過軟單克隆培養(yǎng)，經鑒定為轉化細胞。鏡下觀察，可見正常 規(guī)則狀轉變?yōu)殚L梭形。A B

Blot 檢測 Cx43 在各組細胞中的表達水平t 檢測 Cx43 蛋白的表達變化度值分析：*P<0.05 vs N-B2B；#P<0.05 vs N-B2B Cx43 過表達細胞系Red-Express-C1-Cx43 過表達載體 BEAS-2B 細胞-Express-C1-Cx43 過表達載體轉染正常、轉化 BE取單克隆培養(yǎng)并進行流式細胞術分選，初步獲得微鏡下各組細胞中紅色熒光蛋白表達的情況如圖-Express-C1-Cx43 過表達載體成功轉染正常、轉化

【參考文獻】

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1 劉海霞;陳必良;李佳;陳嘉彥;梁聲茹;;EMT參與腫瘤侵襲轉移的研究進展[J];現代生物醫(yī)學進展;2014年14期

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本文編號：2740629