【摘要】：目的:BMP和Wnt信號通路在角膜緣上皮干細(xì)胞(limbal epithelial stem/progenitor cells,LESCs)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探索BMP和Wnt信號通路在LEPCs調(diào)控中所起的作用及其機(jī)制。方法:使用中性蛋白酶II和胰酶/EDTA消化大鼠角膜緣組織,將單個(gè)細(xì)胞種植于3D-Matrigel中培養(yǎng),并針對BMP信號通路和Wnt信號通路分別行抑制和激活實(shí)驗(yàn),q RT-PCR檢測LEPCs中p63α、CK12、CEBPδ以及CK15等指標(biāo)的表達(dá),免疫熒光染色對其Smad1/5/8及β-catenin進(jìn)行檢測。堿燒傷法造模大鼠LSCD模型,并使用激活了Wnt信號通路的LEPCs治療大鼠LSCD,隨后使用免疫熒光染色、HE染色等方法對其角膜緣組織進(jìn)行檢測。結(jié)果:LEPCs在3D-Matrigel體系當(dāng)中呈細(xì)胞球(cluster樣)生長。LEPCs原本p Smad1/5/8弱陽性,β-catenin呈陰性。當(dāng)培養(yǎng)體系中加入BMP4之后,p Smad1/5/8明顯核表達(dá),說明BMP信號通路激活;培養(yǎng)體系加入Li Cl之后,β-catenin在細(xì)胞膜上高表達(dá),說明Wnt信號通路激活。收集培養(yǎng)第7天的LEPCs,通過q RT-PCR對其進(jìn)行檢測,BMP4組與Li Cl組之間反應(yīng)細(xì)胞干性的指標(biāo)p63α、CK12沒有顯著性差異;BMP組CEBPδ水平明顯升高。反應(yīng)細(xì)胞增殖能力的指標(biāo)Ki-67,BMP4組Ki-67表達(dá)水平降低,而Li Cl組的Ki-67水平明顯升高。BMP和Wnt信號通路阻斷組的LEPCs仍呈cluster樣生長,細(xì)胞團(tuán)形態(tài)無明顯區(qū)別。Noggin組CK12與p63α表達(dá)量均較高,而XAV939組CK12與P63α表達(dá)量均較低。凝膠電泳結(jié)果與實(shí)時(shí)定量相一致。使用激活了Wnt信號通路的LEPCs治療LSCD大鼠之后可以發(fā)現(xiàn),LEPCs明顯促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的修復(fù)和再生,減輕角膜混濁程度,且在大鼠角膜緣組織能夠檢測到Wnt信號通路的激活。結(jié)論:BMP信號通路的激活促進(jìn)LEPCs保持靜止?fàn)顟B(tài),Wnt信號通路的激活增強(qiáng)LEPCs增殖能力,且處于未分化的自我更新狀態(tài);Wnt信號通路激活的LEPCs可促進(jìn)角膜上皮的修復(fù)和再生,減輕角膜混濁程度;對Wnt信號通路的調(diào)控有望為LSCD的治療提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2
【圖文】：

28圖 1.取 SD 大鼠角膜緣組織，獲取其角膜緣上皮干細(xì)胞，于 3D-Matrigel 環(huán)境中構(gòu)建角膜緣上皮干細(xì)胞體外研究模型�？梢� LEPCs 在 3D-Matrigel 環(huán)境中呈cluster樣生長在培養(yǎng)體系中加入BMP4和LiCl之后，細(xì)胞仍然呈cluster樣生長，細(xì)胞團(tuán)稍顯緊密（圖 1），但二者之間無明顯差異。比例尺=100μm。A．

29圖 2.BMP 和 Wnt 信號通路激活3D-Matrigel 體系中的 LEPCs 原本 Smad1/5/8 呈弱陽性，β-catenin 呈陰性。在培養(yǎng)體系當(dāng)中加入 BMP4 之后，Smad1/5/8 明顯呈現(xiàn)核表達(dá)，說明 BMP信號通路被激活；培養(yǎng)體系中加入 LiCl 之后，β-catenin 在細(xì)胞膜上呈高表達(dá)，說明 Wnt 信號通路被激活。細(xì)胞核由 DAPI 染色。

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