【摘要】：目的:間充質(zhì)干細胞是一類能夠自我復制,克隆形成和多譜系分化的多能干細胞,正是其多向的分化功能,使其在多方面有著應用前景。WDR5作為WD40蛋白家族的主要成員,在組織再生和骨組織發(fā)育中存在重要的作用,然而其在間充質(zhì)干細胞中的作用尚不明確。因此闡明WDR5是否為調(diào)控間充質(zhì)干細胞的關鍵靶點,為研發(fā)促進牙再生、骨再生的小分子制劑提供理論依據(jù)。方法:1.獲得人間充質(zhì)干細胞2.目的質(zhì)粒的獲取將WDR5的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢獲得,應用Whitehead提供的程序設計WDR5的SiRNA,將其插入慢病毒的shRNA載體pLKO.1上,測序鑒定,最終構建成WDR5 shRNA質(zhì)粒。采用基因合成的方法得到加表面標簽Myc Tag的WDR5基因全長,將其連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒pQCXIN的表達載體上,對序列進行鑒定后,最終構建成WDR5的Myc-WDR5過表達質(zhì)粒。3.包裝以及收集病毒對照組Scramble shRNA(Scramsh)空載體質(zhì)粒、實驗組WDR5 shRNA(WDR5sh)質(zhì)粒及對應的包裝質(zhì)粒(VSVG和dv-8.2)培養(yǎng)于293T細胞中進行病毒的包裝,48小時后將獲取的上清液行病毒滴度測定,平均分裝于凍存管中,-80℃冰箱留存。逆轉(zhuǎn)錄病毒對照空質(zhì)粒pQCXIN、實驗組Myc-WDR5的質(zhì)粒及相應的包裝質(zhì)粒(CPI和GPE)培養(yǎng)于293T細胞中進行病毒的包裝,72小時后將獲取的上清液行病毒滴度測定,平均分裝于凍存管中,-80℃冰箱留存。4.構建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系利用Scramsh以及WDR5sh病毒,分別對間充質(zhì)干細胞進行轉(zhuǎn)染,48小時后對轉(zhuǎn)染后的細胞加入puromycin進行篩選,篩選3天后得到對照Scramsh和WDR5sh病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細胞。為確定病毒的轉(zhuǎn)染效率,對轉(zhuǎn)染后的細胞進行mRNA層面以及蛋白表達層面對間充質(zhì)干細胞WDR5的敲低效果進行檢測。對照組病毒pQCXIN和實驗組病毒Myc-WDR5轉(zhuǎn)染細胞,轉(zhuǎn)染后48小時后對轉(zhuǎn)染病毒的細胞行7天G418的篩選,為確定病毒的轉(zhuǎn)染效率,對轉(zhuǎn)染后的細胞進行mRNA層面以及蛋白表達層面對間充質(zhì)干細胞WDR5的過表達效果進行檢測。5.WDR5對間充質(zhì)干細胞功能影響的體外研究成骨/成牙本質(zhì)分化能力的檢測:用成骨/成牙本質(zhì)誘導的培養(yǎng)液(Millipore)對間充質(zhì)干細胞在體外向成骨/成牙本質(zhì)的方向分化誘導。其中包括細胞在成骨誘導初期指標-堿性磷酸酶活性,晚期分化指標(細胞體外礦化能力)-茜素紅和鈣離子濃度檢測。同時收取誘導過程中細胞并提取mRNA進行檢測,其中包括成骨/成牙分化指標(RUNX2、DSPP、OPN、BSP、DMP-1)在1周、2周、3周表達的變化。成神經(jīng)向分化能力檢測:對間充質(zhì)干細胞在體外進行成神經(jīng)方向分化誘導。其中包括收取成神經(jīng)方向誘導過程中的細胞,提取mRNA后檢測成神經(jīng)分化指標(NCAM、TH、βIII-Tubulin、NerouD)在3天、6天、9天表達量的變化。并觀察細胞誘導后形態(tài)學變化及免疫熒光鑒定神經(jīng)干細胞標記物Nestin和早期神經(jīng)元標記物β-III-Tubulin。成血管向分化檢測:對間充質(zhì)干細胞進行成血管方向分化誘導。在誘導0天、4天、7天、10天時間點收取細胞提取mRNA,檢測RNA各個時期成血管分化指標(ANG-1、VEGF、PDGFA)等的變化。6.統(tǒng)計學分析應用統(tǒng)計學計算軟件SPSS 22.2,根據(jù)t檢驗或方差分析,實驗結果P值小于0.05表示有統(tǒng)計學差異。結果:1.對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)DR5的根尖牙乳頭干細胞,在mRNA和蛋白表達量上進行測定,結果表明轉(zhuǎn)染后的根尖牙乳頭干細胞WDR5基因敲低組與WDR5基因過表達組均存在明顯敲低效果與過表達效果。2.通過檢測5天的ALP活性、3周的ARS染色、以及鈣離子濃度測定和經(jīng)過1周、2周、3周成骨誘導的細胞mRNA,結果表明和對照組相比,敲低WDR5的根尖牙乳頭干細胞中ALP活性、ARS染色、鈣離子濃度明顯增高,成神經(jīng)向分化指標(NCAM、TH、β-III-Tubulin、NerouD),在骨髓間充質(zhì)干細胞中具有相同結果。成血管向分化指標(ANG-1、VEGF、PDGFA),同樣也表達升高,過表達組結果則與之相反。根尖牙乳頭干細胞中過表達WDR5組與對照組相比,成骨/成牙相關分化指標(RUNX2、OPN、BSP、DSPP、DMP1)表達降低。結論:1.WDR5體外抑制間充質(zhì)干細胞早期成骨/成牙指標-ALP活性、體外礦化能力、晚期成骨/成牙分化指標及關鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達。2.WDR5體外抑制間充質(zhì)干細胞神經(jīng)向分化的形態(tài)學改變、神經(jīng)向特異性蛋白表達以及神經(jīng)向分化指標的表達。3.WDR5體外抑制SCAPs成血管向分化指標的表達。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2
【圖文】：

圖 1 WDR5 敲低效果以及過表達效果檢測（A，B）：通過 Real-TimeRT-PCR 實驗結果（A）鑒定，WDR5 敲低效果達 60%（**P≤ 0.01），GAPDH 為內(nèi)參，Western Blot 實驗結果 （B）顯示 WDR5 的敲低效果明顯（**P≤0.01），HSP90 為內(nèi)參。以上均進行三次獨立重復實驗。(C，D）：通過 Real-Time RT-PCR 實驗結果（C）鑒定，WDR5 過表達效果明顯（**P≤0.01），GAPDH 為內(nèi)參，WesternBlot 實驗結果 （D）顯示 WDR5 的過表達效果明顯（** P ≤ 0.01），HSP90 為內(nèi)參。以上均進行三次獨立重復實驗。

圖 2 WDR5 敲低后導致間充質(zhì)干細胞成骨/成牙本質(zhì)向分（A）：SCAPs 由成骨誘導 WDR5 敲低組細胞 3 天后，實驗磷酸酶活性較對照組（Scramsh）無明顯差異；（B）：SCAP培養(yǎng)基誘導3周，對照組（Scramsh）鈣結節(jié)形成、茜素紅染色顯著減弱；（C）：成骨/成牙培養(yǎng)基誘導 3 周時，實驗組（（Scramsh）鈣離子濃度顯著提高（**P≤0.01）；（D）：BMSC敲低組細胞 3 天后，實驗組（WDR5sh）堿性磷酸酶活性較顯增強；（E）：BMSCs 由成骨/成牙本質(zhì)向培養(yǎng)基誘導 2 周鈣結節(jié)形成、茜素紅染色較實驗組（WDR5sh）顯著減弱。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;MLL1/WDR5 complex in leukemogenesis and epigenetic regulation[J];癌癥;2011年04期

本文編號：2739845