【摘要】：目的:間充質(zhì)干細(xì)胞是一類能夠自我復(fù)制,克隆形成和多譜系分化的多能干細(xì)胞,正是其多向的分化功能,使其在多方面有著應(yīng)用前景。WDR5作為WD40蛋白家族的主要成員,在組織再生和骨組織發(fā)育中存在重要的作用,然而其在間充質(zhì)干細(xì)胞中的作用尚不明確。因此闡明WDR5是否為調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的關(guān)鍵靶點(diǎn),為研發(fā)促進(jìn)牙再生、骨再生的小分子制劑提供理論依據(jù)。方法:1.獲得人間充質(zhì)干細(xì)胞2.目的質(zhì)粒的獲取將WDR5的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢獲得,應(yīng)用Whitehead提供的程序設(shè)計(jì)WDR5的SiRNA,將其插入慢病毒的shRNA載體pLKO.1上,測(cè)序鑒定,最終構(gòu)建成WDR5 shRNA質(zhì)粒。采用基因合成的方法得到加表面標(biāo)簽Myc Tag的WDR5基因全長(zhǎng),將其連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒pQCXIN的表達(dá)載體上,對(duì)序列進(jìn)行鑒定后,最終構(gòu)建成WDR5的Myc-WDR5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。3.包裝以及收集病毒對(duì)照組Scramble shRNA(Scramsh)空載體質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)組WDR5 shRNA(WDR5sh)質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)的包裝質(zhì)粒(VSVG和dv-8.2)培養(yǎng)于293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝,48小時(shí)后將獲取的上清液行病毒滴度測(cè)定,平均分裝于凍存管中,-80℃冰箱留存。逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)照空質(zhì)粒pQCXIN、實(shí)驗(yàn)組Myc-WDR5的質(zhì)粒及相應(yīng)的包裝質(zhì)粒(CPI和GPE)培養(yǎng)于293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝,72小時(shí)后將獲取的上清液行病毒滴度測(cè)定,平均分裝于凍存管中,-80℃冰箱留存。4.構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系利用Scramsh以及WDR5sh病毒,分別對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,48小時(shí)后對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入puromycin進(jìn)行篩選,篩選3天后得到對(duì)照Scramsh和WDR5sh病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞。為確定病毒的轉(zhuǎn)染效率,對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行mRNA層面以及蛋白表達(dá)層面對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞WDR5的敲低效果進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組病毒pQCXIN和實(shí)驗(yàn)組病毒Myc-WDR5轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48小時(shí)后對(duì)轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞行7天G418的篩選,為確定病毒的轉(zhuǎn)染效率,對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行mRNA層面以及蛋白表達(dá)層面對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞WDR5的過(guò)表達(dá)效果進(jìn)行檢測(cè)。5.WDR5對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞功能影響的體外研究成骨/成牙本質(zhì)分化能力的檢測(cè):用成骨/成牙本質(zhì)誘導(dǎo)的培養(yǎng)液(Millipore)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞在體外向成骨/成牙本質(zhì)的方向分化誘導(dǎo)。其中包括細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)初期指標(biāo)-堿性磷酸酶活性,晚期分化指標(biāo)(細(xì)胞體外礦化能力)-茜素紅和鈣離子濃度檢測(cè)。同時(shí)收取誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞并提取mRNA進(jìn)行檢測(cè),其中包括成骨/成牙分化指標(biāo)(RUNX2、DSPP、OPN、BSP、DMP-1)在1周、2周、3周表達(dá)的變化。成神經(jīng)向分化能力檢測(cè):對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞在體外進(jìn)行成神經(jīng)方向分化誘導(dǎo)。其中包括收取成神經(jīng)方向誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞,提取mRNA后檢測(cè)成神經(jīng)分化指標(biāo)(NCAM、TH、βIII-Tubulin、NerouD)在3天、6天、9天表達(dá)量的變化。并觀察細(xì)胞誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)變化及免疫熒光鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin和早期神經(jīng)元標(biāo)記物β-III-Tubulin。成血管向分化檢測(cè):對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成血管方向分化誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)0天、4天、7天、10天時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞提取mRNA,檢測(cè)RNA各個(gè)時(shí)期成血管分化指標(biāo)(ANG-1、VEGF、PDGFA)等的變化。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算軟件SPSS 22.2,根據(jù)t檢驗(yàn)或方差分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果P值小于0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:1.對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)DR5的根尖牙乳頭干細(xì)胞,在mRNA和蛋白表達(dá)量上進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后的根尖牙乳頭干細(xì)胞WDR5基因敲低組與WDR5基因過(guò)表達(dá)組均存在明顯敲低效果與過(guò)表達(dá)效果。2.通過(guò)檢測(cè)5天的ALP活性、3周的ARS染色、以及鈣離子濃度測(cè)定和經(jīng)過(guò)1周、2周、3周成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞mRNA,結(jié)果表明和對(duì)照組相比,敲低WDR5的根尖牙乳頭干細(xì)胞中ALP活性、ARS染色、鈣離子濃度明顯增高,成神經(jīng)向分化指標(biāo)(NCAM、TH、β-III-Tubulin、NerouD),在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中具有相同結(jié)果。成血管向分化指標(biāo)(ANG-1、VEGF、PDGFA),同樣也表達(dá)升高,過(guò)表達(dá)組結(jié)果則與之相反。根尖牙乳頭干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)WDR5組與對(duì)照組相比,成骨/成牙相關(guān)分化指標(biāo)(RUNX2、OPN、BSP、DSPP、DMP1)表達(dá)降低。結(jié)論:1.WDR5體外抑制間充質(zhì)干細(xì)胞早期成骨/成牙指標(biāo)-ALP活性、體外礦化能力、晚期成骨/成牙分化指標(biāo)及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。2.WDR5體外抑制間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)向分化的形態(tài)學(xué)改變、神經(jīng)向特異性蛋白表達(dá)以及神經(jīng)向分化指標(biāo)的表達(dá)。3.WDR5體外抑制SCAPs成血管向分化指標(biāo)的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

圖 1 WDR5 敲低效果以及過(guò)表達(dá)效果檢測(cè)（A，B）：通過(guò) Real-TimeRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（A）鑒定，WDR5 敲低效果達(dá) 60%（**P≤ 0.01），GAPDH 為內(nèi)參，Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （B）顯示 WDR5 的敲低效果明顯（**P≤0.01），HSP90 為內(nèi)參。以上均進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。(C，D）：通過(guò) Real-Time RT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（C）鑒定，WDR5 過(guò)表達(dá)效果明顯（**P≤0.01），GAPDH 為內(nèi)參，WesternBlot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （D）顯示 WDR5 的過(guò)表達(dá)效果明顯（** P ≤ 0.01），HSP90 為內(nèi)參。以上均進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

圖 2 WDR5 敲低后導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)向分（A）：SCAPs 由成骨誘導(dǎo) WDR5 敲低組細(xì)胞 3 天后，實(shí)驗(yàn)磷酸酶活性較對(duì)照組（Scramsh）無(wú)明顯差異；（B）：SCAP培養(yǎng)基誘導(dǎo)3周，對(duì)照組（Scramsh）鈣結(jié)節(jié)形成、茜素紅染色顯著減弱；（C）：成骨/成牙培養(yǎng)基誘導(dǎo) 3 周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組（（Scramsh）鈣離子濃度顯著提高（**P≤0.01）；（D）：BMSC敲低組細(xì)胞 3 天后，實(shí)驗(yàn)組（WDR5sh）堿性磷酸酶活性較顯增強(qiáng)；（E）：BMSCs 由成骨/成牙本質(zhì)向培養(yǎng)基誘導(dǎo) 2 周鈣結(jié)節(jié)形成、茜素紅染色較實(shí)驗(yàn)組（WDR5sh）顯著減弱。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;MLL1/WDR5 complex in leukemogenesis and epigenetic regulation[J];癌癥;2011年04期

本文編號(hào)：2739845