【摘要】：長非編碼RNA(long-noncoding RNA,lncRNA)類型眾多,且作用方式復(fù)雜多樣,可以與DNA、RNA和蛋白等結(jié)合發(fā)揮“支架”、“引導(dǎo)”、“海綿”等等作用,對基因表達的調(diào)控具有很高的精密性。精子發(fā)生(Spermatogenesis)是極其復(fù)雜而特異的細(xì)胞分化過程,相較于體細(xì)胞的分化,歷經(jīng)了許多重要的特殊事件,這些事件都在精密的調(diào)控下進行。因此,lncRNA在精子發(fā)生中很有可能也扮演著重要調(diào)控者的角色。但是,至今lncRNA在精子發(fā)生中的功能與機制研究還比較少。所以,深入研究lncRNA在精子發(fā)生過程中的功能與機制,對解決男性不育這世界性醫(yī)學(xué)難題將具有重要意義。有研究表示RNA結(jié)合蛋白QKI可以和相應(yīng)lncRNA結(jié)合發(fā)揮功能,在神經(jīng)發(fā)育、血管發(fā)育和腫瘤發(fā)生等領(lǐng)域,具有調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移等作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)QKI5在睪丸組織中表達水平相對較高,尤其在4 w和5 w的睪丸組織中,主要在粗線期精母細(xì)胞表達水平最高;在細(xì)胞系上發(fā)現(xiàn)QKI5在GCl-spg中表達水平較高,主要定位于細(xì)胞核,部分位于細(xì)胞質(zhì)中。RIP-seq和生信分析發(fā)現(xiàn),在MAPK信號通路上高富集,而此信號通路大多與細(xì)胞凋亡、增殖和分化相關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上,著重開展QKI5在精子發(fā)生中的功能。我們首先探索了 QKI5在細(xì)胞凋亡中的作用。利用siRNA抑制GCl-spg細(xì)胞中內(nèi)源QKI5蛋白的表達,分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h加入Etoposide誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,采用流式細(xì)胞儀檢測GCl-spg細(xì)胞凋亡的比例變化。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著Etoposide誘導(dǎo)時間增長,對照組和實驗組的凋亡比例都在增加,但是實驗組的細(xì)胞凋亡比例明顯低于對照組。表明抑制QKI5的表達水平可以抑制GCl-spg細(xì)胞的凋亡,即QKI5在生精細(xì)胞中對細(xì)胞凋亡有促進作用。實驗還發(fā)現(xiàn)si-QKI5實驗組的cleaved caspase3表達量變化明顯,且作為caspase3凋亡前期的p38-MAPK信號通路中p-p38、p38等關(guān)鍵分子及其信號通路上游PARP蛋白的表達水平與對照組形成明顯差異。表明在生精細(xì)胞中QKI5是通過活化p38-MAPK信號通路來促進細(xì)胞凋亡。前期通過RIP、RNA-pulldown和生信分析,最終篩選出QKI5結(jié)合的13條候選lncRNA。其中l(wèi)nc6和lnc11有組織特異性,與QKI5的變化趨勢大體一致,并將目標(biāo)最后指向lnc6。本研究中采用RNA-pulldown進行反向驗證,結(jié)果顯示反義鏈探針可以同時檢出lnc6和QKI5,表明lnc6與QK5相互結(jié)合,確認(rèn)了 lnc6為QKI5結(jié)合的長鏈非編碼RNA。隨即開展了對lnc6的功能認(rèn)識。在不同組織、六種不同時期生精細(xì)胞、不同發(fā)育時期的睪丸組織、四種不同生殖細(xì)胞系和細(xì)胞定位等檢測了 lnc6的表達量,發(fā)現(xiàn)lnc6在睪丸組織中表達量相對較高,尤其前期生精細(xì)胞表達量最高,定位在細(xì)胞核。我們用siRNA抑制GCl-spg細(xì)胞內(nèi)源lnc6的表達,再加入Etoposide處理細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,檢測GCl-spg細(xì)胞凋亡的比例變化。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著Etoposide誘導(dǎo)時間增長,對照組和實驗組的凋亡比例都在增加,但是實驗組的細(xì)胞凋亡比例明顯高于對照組,表明了抑制lnc6的表達可以促進GCl-spg細(xì)胞的凋亡;實驗組的PARP蛋白、p-p38蛋白、p38蛋白的表達水平也隨之發(fā)生了相應(yīng)變化。結(jié)果顯示在生精細(xì)胞中l(wèi)nc6是可以抑制GCl-spg細(xì)胞的凋亡,是通過抑制p38-MAPK信號通路來實現(xiàn)的,這與QKI5的作用正好拮抗。進而探索QKI5和lnc6是如何調(diào)控細(xì)胞凋亡的?我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制lnc6時,p38-MAPK信號通路中的mapk11、mapk12和mapk14的RNA穩(wěn)定性增高;而當(dāng)抑制QKI5表達時,lnc6的表達量相比對照組有微弱上升趨勢;當(dāng)過表達外源性lnc6,發(fā)現(xiàn)cleaved caspase3、p-p38、p38和PARP等蛋白的表達量低于對照組;而同時抑制lnc6和QKI5時,也發(fā)現(xiàn)si-lnc6/QKI5實驗組的表達量介于si-lnc6、si-QKI5組之間,與NC對照組有大致相同趨勢。這些實驗結(jié)果也驗證了以下推測:正常情況下,QKI5可以維持p38-MAPK的mRNA和lnc6的穩(wěn)定性;當(dāng)QKI5缺失時,p38-MAPK的mRNA不能被QKI5穩(wěn)定,故而不能正常翻譯,從而使得cleavedcaspase3表達被抑制,細(xì)胞凋亡過程被抑制;當(dāng)lnc6被抑制時,QKI5與lnc6結(jié)合位點被大量釋放,QKI5與p38-MAPK的結(jié)合位點增多,從而使得p38-MAPK的mRNA被QKI5穩(wěn)定,使得cleaved caspase3表達被激活,從而促進細(xì)胞凋亡。p38-MAPK的mRNA與lnc6可能通過競爭性結(jié)合QKI5的結(jié)合位點從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。綜上,我們在體外研究了 QKI5及其結(jié)合的lnc6在精子發(fā)生中的功能和機制:發(fā)現(xiàn)QKI5可以通過活化p38-MAPK信號通路來促進細(xì)胞凋亡;同時確認(rèn)了 lnc6可與QKI5結(jié)合,其可以通過抑制p38-MAPK信號通路來抑制細(xì)胞凋亡;QKI5與lnc6的作用機制可能是通過競爭調(diào)節(jié)模式來調(diào)控細(xì)胞凋亡。在研究QKI5對細(xì)胞凋亡影響的同時,我們還利用CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建了 qki基因敲除的GCl-spg細(xì)胞株,通過篩選和鑒定,獲得1#靶點單細(xì)胞株3株,2#靶點單細(xì)胞株3株,最終選擇GTCCGAG的堿基缺失突變體1#06作為研究細(xì)胞增殖和分化實驗的材料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)cas-QKI5實驗組細(xì)胞增殖明顯慢于對照組的細(xì)胞增殖趨勢(*P0.05);檢測減數(shù)分裂相關(guān)分子標(biāo)志物c-kit、Mtl5和Hspa2的表達水平,發(fā)現(xiàn)實驗組顯著低于對照組。這表明QKI5也具有促進細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的功能。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R321.1
【圖文】：

ｌｎｃ６是否確實為ＱＫＩ５結(jié)合的長鏈非編碼ＲＮＡ？我們采用ＲＮＡ－ｐｕｌｌｄｏｗｎ進行了逡逑反向驗證。根據(jù)ｌｎｃ６設(shè)計了正義和反義鏈探針（靶點序列見表８），結(jié)果可見反義鏈探逡逑針可以檢出ｌｎｃ６邋（圖３Ａ）和ＱＫＩ５邋（圖３Ｂ），表明ｌｎｃ６與ＱＫ５相結(jié)合。逡逑據(jù)此，我們最終確定以ｌｎｃ６為對象，研究ＱＫＩ５與ｌｎｃ６的相互作用和功能。逡逑１００－，逡逑§９０－逡逑＇Ｚ邋ｓｏ－逡逑７。．邋■！逡逑ｅ叨＿邋ｍ逡逑ａ邐Ｉｎｐｕｔ邋ＡＳ邋ＳＳ逡逑！邋邐逡逑！邐■邐ＱＫＩ５邋＿逡逑＾邋孑邋／邋Ｔｕｂｕｌｉｎ邋？？逡逑Ａ邐Ｂ逡逑圖３邋ｌｎｃ６與ＱＫＩ５相互作用的檢測逡逑Ａ：根據(jù)ｌｎｃ６設(shè)計的正義鏈和反義鏈探針ｐｕｌｌｄｏｗｎ檢出的相應(yīng)三組ｌｎｃ６的相對含逡逑量；Ｂ：三組ｐｕｌｌｄｏｗｎ檢出的ＱＫＩ５蛋白的相對含量。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３邋Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｌｎｃ６邋ａｎｄ邋ＱＫＩ５逡逑Ａ：邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ邋ｔｌｉｒｅｅ邋ｇｒｏｕｐｓ邋ｏｆ邋ｌｎｃ６邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ逡逑ｐｕｌｌｄｏｗｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｅｎｓｅ邋ａｎｄ邋ａｎｔｉｓｅｎｓｅ邋ｓｔｒａｎｄ邋ｐｒ

３．１邋ｌｎｃ６的基本信息逡逑我們檢測了邋ｌｎｃ６的組織表達譜，在腦、心、腎、肝、肺、肌肉、脾和睪丸等組織逡逑中的表達情況，發(fā)現(xiàn)ｌｎｃ６在睪丸組織中表達量相對較高（圖４Ａ）；我們分離了睪丸中逡逑的生精細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)ｌｎｃ６在生精細(xì)胞中表達量最高（圖４Ｂ）；逡逑進一步我們檢測了不同發(fā)育階段生精細(xì)胞中的表達情況，通過重力沉降法分離得到Ａ逡逑型精原細(xì)胞、Ｂ型精原細(xì)胞、前細(xì)線期精母細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞、圓形精子和長型逡逑精子六種不同時期生精細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ｌｎｃ６在前期表達量相對較高；在不同發(fā)育時期的睪逡逑丸組織中，發(fā)現(xiàn)ｌｎｃ６在１０邋ｄ和１４邋ｄ的睪丸組織中表達量最高（圖４Ｃ）：此外，我們還逡逑對wj丸組織中的四株細(xì)胞系進行檢測，其中兩株為生精細(xì)胞ＧＣｌ－ｓｐｇ、ＧＣ２－ｓｐｇ，兩株逡逑為Ｓｅｒｔｏｌｉ細(xì)胞ＴＭ３、ＴＭ４，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)ｌｎｃ６在ＧＣｌ－ｓｐｇ細(xì)胞中表達量最高（圖４Ｄ）。逡逑＝１0１邋§５１逡逑！：邋｜邐１｜逡逑Ｉ邋？福逡逑ｉｊ＿邋＿邋＿逡逑／／／＂／／／邋／邋／邋／逡逑Ａ邐Ｂ逡逑１．５－１邐０．２５－逡逑１邐ｌａ邐ｆ：ｉ逡逑ｉ邋ｋＵＵｌｌ逡逑々邋＞邋汐＃邋＃邋＃邋＃邐＃邋00ａ邋參邋＾逡逑

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