【摘要】：研究目的:免疫系統(tǒng)人源化小鼠是研究最多應(yīng)用最廣的人源化小鼠之一,其特點是具有人的免疫系統(tǒng),被認(rèn)為是生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的理想小動物模型。經(jīng)過幾十年的研究和發(fā)展,該模型日趨成熟。但因缺乏某些人類細(xì)胞發(fā)育存活所必需的細(xì)胞因子,導(dǎo)致某些血系細(xì)胞重建效果不佳。有報道顯示小鼠IL 4、GM-CSF、CSF、IL 3等細(xì)胞因子有種屬特異性,與人類細(xì)胞無交叉反應(yīng)。外源補充人IL15、EPO及IL 3給免疫系統(tǒng)人源化小鼠可增加人NK和紅細(xì)胞的重建比例。因此,補充合適的細(xì)胞因子可彌補當(dāng)前人源化小鼠模型髓系和紅系細(xì)胞重建不佳的缺陷,使該模型得到更廣泛的應(yīng)用。因此本課題通過構(gòu)建含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF五種細(xì)胞因子的表達(dá)質(zhì)粒,利用PiggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子體系將目的基因整合到宿主小鼠細(xì)胞基因組中實現(xiàn)長期表達(dá),以此優(yōu)化免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型。研究方法:利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF五種細(xì)胞因子的表達(dá)質(zhì)粒(PB-5F);經(jīng)氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選,挑取單克隆進(jìn)行NheI和BamHI雙酶切以及瓊脂糖電泳篩選出含有目的基因大小的陽性克隆;陽性克隆送庫美生物科技有限公司測序;采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有綠色熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒(PB-GFP)和PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒(Super PB)按2.5:1的比例共轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞系,利用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測綠色熒光蛋白的表達(dá);將目的質(zhì)粒(PB-5F)(50μg/只)和Super PB(20μg/只)混合后高壓注射入NCG免疫缺陷小鼠體內(nèi),在確定的時間點取小鼠血清,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分別檢測5種細(xì)胞因子的表達(dá)、含量及持續(xù)時間。研究結(jié)果:PB-5F質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳證明,插入片段與目的基因5F片段大小相符,測序結(jié)果證明插入序列與5F基因序列一致。體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗顯示,在細(xì)胞轉(zhuǎn)染7天內(nèi)瞬時轉(zhuǎn)染組GFP陽性率與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組沒有明顯差異;隨后瞬時轉(zhuǎn)染組幾乎檢測不到GFP的表達(dá),而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組可以維持30天以上的表達(dá)。小鼠血清中人的細(xì)胞因子在注射后第5天瞬時轉(zhuǎn)染組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組各細(xì)胞因子之間無統(tǒng)計學(xué)差異,與體外轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果一致;2個月后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組依然能檢測到人細(xì)胞因子的表達(dá)。研究結(jié)論:(1)成功構(gòu)建了含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF基因的PB轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒PB-5F;(2)PB轉(zhuǎn)座子體系可維持人類細(xì)胞因子在小鼠體內(nèi)的長期表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

圖 2.2 多種人源化小鼠示意圖[42]型的幾類人源化小鼠模型。通過移植人的不同組織、細(xì)胞等構(gòu)建不同種類的人源化小鼠模型，應(yīng)用于人類相關(guān)領(lǐng)域研究。.2 免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的應(yīng)用人源化小鼠的出現(xiàn)為醫(yī)學(xué)研究提供了前所未有的機(jī)會。這些模型體積小容作，且繁育周期短。此外，人源化小鼠允許人類特異性病原體在其中感染和，并且能夠針對一系列疾病開發(fā)功能性人類特異性免疫應(yīng)答。許多疾病機(jī)制完全清楚，因此，利用人源化小鼠可以使研究人員了解促進(jìn)醫(yī)學(xué)問題發(fā)展的因素，包括傳染病，自身免疫和癌癥等。2.1 感染性疾病

圖 2.3 各類細(xì)胞因子在造血過程中的作用[71]液淋巴系統(tǒng)發(fā)育和維持生存所需的關(guān)鍵因素的非詳盡列表，顏色代碼表人類和小鼠蛋白質(zhì)之間氨基酸同一性的百分比。 DNA 的轉(zhuǎn)座研究基因功能，在許多情況下需要在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)持續(xù)高水平的轉(zhuǎn)基傳統(tǒng)上應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體來實現(xiàn)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)[72]。然而毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)常常處于較低水平，并且由于低拷貝和/或染色質(zhì)而可以隨時減少[73, 74]。DNA 轉(zhuǎn)座子提供了永久修飾哺乳動物細(xì)胞基因組病毒方法[74]。轉(zhuǎn)座因子或轉(zhuǎn)座子（Transposable elements 或 Transponsons 于基因組中可自主移動或復(fù)制自己并整合到新位點的 DNA 片段[75]，位過程稱作轉(zhuǎn)座。自 20 世紀(jì) 40 年代美國女科學(xué)家 Barbara McClintock[76]

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 沈丹;謝雨t;李慶平;薛松磊;史云強;王賽賽;陳才;錢躍;高波;崔恒宓;宋成義;;多轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)座特性比較研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年11期

2 郝景芳;;你永遠(yuǎn)不知道一樣?xùn)|西真正的用處[J];文苑(經(jīng)典美文);2016年12期

3 倪欣濤;盧鳳英;苗雙;朱寅玉;邢林林;俞慧;祁晶晶;王桂軍;胡青海;;鴨疫里氏桿菌轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變庫的構(gòu)建[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2014年04期

4 李永文;姚毅冰;萬海粟;周清華;;“睡美人”轉(zhuǎn)座子及其在腫瘤研究中的應(yīng)用[J];中國肺癌雜志;2008年06期

5 劉冬;;轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用[J];中國牧業(yè)通訊;2008年07期

6 黃春;張萬江;;轉(zhuǎn)座子及其相關(guān)技術(shù)的研究[J];世界華人消化雜志;2006年17期

7 王志耘;李文成;陶美鳳;;一個鏈霉菌中微型轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的構(gòu)建[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年06期

8 黃坤艷,饒力群,儲成才;轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法及其在水稻功能基因組研究中的應(yīng)用[J];高技術(shù)通訊;2003年06期

9 廖鳴娟,董愛華,王正棟,朱睦元;植物轉(zhuǎn)座子及其在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用[J];遺傳;2000年05期

10 李鳳玲,趙毓橘;植物轉(zhuǎn)座子[J];植物生理學(xué)通訊;2000年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 高才華;肖美麗;任小東;Alice Hayward;殷家明;付東輝;李加納;;真核生物基因組中嵌合轉(zhuǎn)座子的特征分析和功能注釋[A];中國遺傳學(xué)會第九次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編（2009-2013）[C];2013年

2 嚴(yán)冰;曾慶韜;錢遠(yuǎn)槐;;黑腹果蠅黑條體突變體中轉(zhuǎn)座子分布的多樣性研究[A];中國動物科學(xué)研究——中國動物學(xué)會第十四屆會員代表大會及中國動物學(xué)會65周年年會論文集[C];1999年

3 錢躍;陳才;沈丹;薛松磊;王賽賽;史云強;高波;王宵燕;崔恒宓;宋成義;;九種硬骨魚基因組轉(zhuǎn)座子分布及擴(kuò)增差異研究[A];遺傳多樣性：前沿與挑戰(zhàn)——中國的遺傳學(xué)研究（2013-2015）——2015中國遺傳學(xué)會大會論文摘要匯編[C];2015年

4 周祥;白林泉;鄧子新;;井岡霉素產(chǎn)生菌的全基因組轉(zhuǎn)座子突變[A];2008年中國微生物學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2008年

5 曲志才;姜曰水;;山東部分地區(qū)灰飛虱mariner類轉(zhuǎn)座子研究[A];中國遺傳學(xué)會第八次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

6 吳小鋒;曹翠平;魯興萌;;利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建適用于家蠶的快速桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)[A];中國蠶學(xué)會第七屆二次理事會暨學(xué)術(shù)年會論文集[C];2005年

7 徐小平;孔繁榮;蔡林;Shahin Oftadeh;周飛;Gwendolyn L.Gilbert;;紅霉素耐藥肺炎鏈球菌的血清型、耐藥基因和轉(zhuǎn)座子相關(guān)研究[A];首屆中國臨床微生物學(xué)大會（寧波會議）暨《醫(yī)學(xué)參考報》微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2010年

8 張云峰;;小麥中轉(zhuǎn)座子存在的可能性初探[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

9 吳小鋒;曹翠平;姚慧鵬;魯興萌;Mark Robertson;;利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建適用于家蠶的快速桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)[A];中國蠶學(xué)會第四屆青年學(xué)術(shù)研討會會議論文集[C];2004年

10 王曉明;王亞賓;胡功政;李新生;張素梅;潘玉善;商艷紅;杜向黨;;新型接合型轉(zhuǎn)座子Tn6247的鑒定及分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會第十一屆會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)討論會與中國毒理學(xué)會獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會第五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2015年

相關(guān)重要報紙文章 前5條

1 記者 聶翠蓉;全基因組擴(kuò)增實現(xiàn)百分之九十七覆蓋率[N];科技日報;2017年

2 馮衛(wèi)東;轉(zhuǎn)座子榮居自然界最豐富基因榜首位[N];科技日報;2010年

3 本報記者 馮衛(wèi)東;遺傳基因中的“侵略者”[N];科技日報;2008年

4 記者 吳少敏 通訊員 蔡珊珊;發(fā)現(xiàn)6億年前免疫“分子活化石”[N];南方日報;2016年

5 馮衛(wèi)東;進(jìn)化之旅：三十億歲的DNA[N];中國航空報;2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 殷豪;梨基因組LTR反轉(zhuǎn)座子注釋及進(jìn)化分析研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 武紅玉;二穗短柄草Ac/Ds轉(zhuǎn)座體系的構(gòu)建及其應(yīng)用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 張化浩;家蠶基因組中轉(zhuǎn)座子的水平轉(zhuǎn)移[D];重慶大學(xué);2014年

4 張森;利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)定向突變擬南芥基因以及擬南芥FA121和FA254兩基因功能的研究[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2004年

5 龍麗坤;高壓誘導(dǎo)水稻發(fā)生可遺傳DNA甲基化變異和轉(zhuǎn)座子mPing及Pong的轉(zhuǎn)座激活[D];東北師范大學(xué);2006年

6 李竹紅;用轉(zhuǎn)座子與RNA/DNA嵌合寡核苷酸探討靶向性基因治療[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2000年

7 丁f;piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

8 單曉輝;菰DNA漸滲誘發(fā)水稻內(nèi)源轉(zhuǎn)座子mPing、Pong的轉(zhuǎn)座激活[D];東北師范大學(xué);2007年

9 沈野;菰DNA漸滲誘導(dǎo)水稻內(nèi)源LTR類反轉(zhuǎn)座子的遺傳和表觀遺傳變異[D];東北師范大學(xué);2008年

10 葉晨波;電擊介導(dǎo)和Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的人凝血因子Ⅸ基因表達(dá)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李旭;石刁柏基因組轉(zhuǎn)座子的組成與定位[D];河南師范大學(xué);2018年

2 楊勤帥;轉(zhuǎn)座子Tgm9的演化和應(yīng)用[D];西北大學(xué);2018年

3 常恩潔;大豆轉(zhuǎn)座子Tgm9轉(zhuǎn)座機(jī)制的研究[D];西北大學(xué);2018年

4 占U

本文編號：2738400