發(fā)布時間：2017-03-29 00:10

  本文關(guān)鍵詞：Vero細胞無血清培養(yǎng)基的研制及其在流感病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流行性感冒是人類至今不能有效控制的傳染病之一,每次流行都給人類的健康和經(jīng)濟造成重大的損失。雖然有抗病毒藥物,但可能誘導耐藥株出現(xiàn),不適合大范圍長時間來應(yīng)對流行性感冒。目前接種疫苗仍被認為是預防流感的最好方法。傳統(tǒng)的流感疫苗以雞胚為培養(yǎng)基質(zhì),生產(chǎn)過程容易受到微生物的污染、不能大規(guī)模生產(chǎn)、對流感大流行應(yīng)急能力差等,因此基于動物細胞為基質(zhì)生產(chǎn)的流感疫苗成為疫苗發(fā)展的重要方向。非洲綠猴腎細胞系Vero是世界衛(wèi)生組織WHO推薦的人用疫苗生產(chǎn)基質(zhì),目前已用于多種疫苗的生產(chǎn),其安全性已得到認證。在流感大流行時,如何提高細胞培養(yǎng)技術(shù)水平以提高流感疫苗的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率及病毒的培養(yǎng)條件成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)及疫苗生產(chǎn)的目標和競爭核心。動物細胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā),將實現(xiàn)流感疫苗高效率、低成本的生產(chǎn),成為流感疫苗開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。因此,本文借助統(tǒng)計學方法開發(fā)適用于Vero細胞生長的無血清培養(yǎng)基。首先,本文通過連續(xù)運用單因素實驗—Plackett-Burman實驗—最陡爬坡實驗—中心組合實驗5種統(tǒng)計學方法,建立了Vero細胞無血清培養(yǎng)基快速高效的開發(fā)技術(shù)。通過單因素實驗設(shè)計確定了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、表皮生長因子、透明質(zhì)酸和亞硒酸鈉在后續(xù)實驗中的添加濃度,考察的濃度范圍分別為胰島素3-6ug/mL,轉(zhuǎn)鐵蛋白7.5-15ug/mL、高密度脂蛋白10-2Oug/mL、牛血清白蛋白2-4mg/mL、表皮生長因子50-100ng/mL、透明質(zhì)酸15-30mg/mL、亞硒酸鈉4-8mmol/mL;進一步通過Plackett-Burman實驗考察胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、表皮生長因子、透明質(zhì)酸和亞硒酸鈉7種添加物對Vero細胞生長的影響作用大小,方差分析結(jié)果表明胰島素、牛血清白蛋白對Vero細胞的生長有顯著正影響作用(p0.05),轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、透明質(zhì)酸有正影響作用(p0.05),而高密度脂蛋白和亞硒酸鈉對細胞生長存在負影響作用；又通過最陡爬坡實驗拓寬胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白的濃度范圍,3種添加物的濃度分別為5.4ug/mL,13.8ug/mL,3.6mg/mL時,測定的OD490值最大；最后通過中心組合實驗確定胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白的最佳濃度條件,分別為胰島素5.625ug/mL,轉(zhuǎn)鐵蛋白14.034ug/mL,牛血清白蛋白3.92mg/mL,按此條件配制的無血清培養(yǎng)基可支持Vero細胞的連續(xù)培養(yǎng)。隨后,利用Vero細胞無血清培養(yǎng)培養(yǎng)體系,對Vero細胞培養(yǎng)H5N1流感病毒過程的MOI及TPCK-胰蛋白酶的添加量進行優(yōu)化,自配無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)H5N1流感病毒的條件為：接種量MOI為0.001,TPCK-胰蛋白酶的添加量1ug/mL,并且每隔24h補加初始濃度的TPCK-胰蛋白酶。在優(yōu)化的H5N1流感病毒生產(chǎn)條件下,自配無血清培養(yǎng)基和Gibco商品化無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)H5N1流感病毒的的HA及感染性滴度沒有顯著性差別,但都低于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基、自配無血清培養(yǎng)基和Gibco商品化無血清培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基培養(yǎng)出的病毒HA滴度分別為：512HAU/50uL、277.3HAU/50uL、149.3HAU/50uL,感染性滴度分別為：108.375±0.25TCID50/mL、107.75±0.06TCID5o/mL 和 107.32±0.12TCID50/mL。表明自配無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)體系適于流感病毒疫苗的生產(chǎn),但和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)體系相比仍有一定的差別。目前,仍不能應(yīng)用于規(guī)�；鞲幸呙绲纳a(chǎn),需繼續(xù)對此無血清培養(yǎng)基的配方繼續(xù)進行優(yōu)化。
【關(guān)鍵詞】：Vero細胞 無血清培養(yǎng)基 統(tǒng)計學方法 H5N1流感病毒
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R373.13
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-17
• 第一部分 Vero細胞無血清培養(yǎng)基的研制17-48
• 1. 實驗材料17-18
• 1.1 細胞株17
• 1.2 細胞培養(yǎng)基17
• 1.3 細胞培養(yǎng)基添加成分17
• 1.4 實驗試劑17-18
• 1.5 主要儀器設(shè)備18
• 2. 實驗方法18-27
• 2.1 種子細胞復蘇18-19
• 2.2 細胞傳代19
• 2.3 細胞無血清饑餓19
• 2.4 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)化19-20
• 2.5 無血清細胞凍存20
• 2.6 分析方法20-22
• 2.6.1 細胞形態(tài)學觀察20
• 2.6.2 細胞計數(shù)20-21
• 2.6.3 長期穩(wěn)定性實驗21
• 2.6.4 細胞生長曲線繪制21
• 2.6.5 CCK-8法測定細胞增值21-22
• 2.7 統(tǒng)計學分析22
• 2.8 無血清培養(yǎng)基優(yōu)化設(shè)計22-26
• 2.8.1 單因素實驗23
• 2.8.2 Plackett-Burman實驗設(shè)計23-25
• 2.8.3 最陡爬坡實驗25
• 2.8.4 中心組合實驗25-26
• 2.9 優(yōu)化組合驗證26-27
• 3. 結(jié)果和分析27-38
• 3.1 單因素實驗27-29
• 3.2 Plackett-Burman實驗結(jié)果29-30
• 3.3 最陡爬坡實驗結(jié)果30-32
• 3.4 中心組合實驗結(jié)果32-35
• 3.5 優(yōu)化組合的驗證35
• 3.6 長期穩(wěn)定性實驗35-37
• 3.7 細胞生長曲線測定37-38
• 討論38-40
• 小結(jié)40-41
• 參考文獻41-48
• 第二部分 Vero細胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)H5N1流感病毒48-63
• 1. 實驗材料48-49
• 1.1 病毒株48
• 1.2 細胞株48
• 1.3 主要儀器設(shè)備48-49
• 1.4 實驗試劑49
• 2. 實驗方法49-51
• 2.1 流感病毒A/Anhui/1/2005 Va(H5N1)的擴增49-50
• 2.2 流感病毒A/Anhui/1/2005 Va(H5N1)的收獲50
• 2.3 MOI的計算50
• 2.4 病毒測定50-51
• 2.4.1 感染性滴度測定(TCID50)50-51
• 2.4.2 病毒血凝值(HA)測定51
• 2.5 統(tǒng)計學分析51
• 3. 結(jié)果與分析51-59
• 3.1 流感病毒感染SFM-Vero20細胞的條件優(yōu)化51-56
• 3.1.1 TPCK-胰蛋白酶添加量的優(yōu)化51-53
• 3.1.2 補加TPCK-胰蛋白酶的影響53-54
• 3.1.3 MOI的優(yōu)化54-56
• 3.2 三種培養(yǎng)基中Vero細胞生產(chǎn)病毒情況對比56-59
• 討論59-61
• 小結(jié)61-62
• 參考文獻62-63
• 附錄Ⅰ縮略詞表63-64
• 附錄Ⅱ 主要溶液及培養(yǎng)基配置64-70
• 致謝70-71
• 個人簡歷71-73

【引證文獻】

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馮婷;涂文偉;黃娟;李晉蓉;殷仲偉;范營營;李虹;;流感病毒H1N1在MDCK細胞的培養(yǎng)及純化條件的優(yōu)化[A];第五次全國免疫診斷暨疫苗學術(shù)研討會論文匯編[C];2011年

  本文關(guān)鍵詞：Vero細胞無血清培養(yǎng)基的研制及其在流感病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：273305