發(fā)布時(shí)間：2017-03-28 19:17

  本文關(guān)鍵詞：蘋果酸合成酶Glcb基因克隆及表達(dá)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核病(tuberculosis)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的慢性傳染性疾病,結(jié)核桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后,在巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)為持留狀態(tài),通過乙醛酸循環(huán)途徑獲取能量,維持其在宿主體內(nèi)的長期持留存在。蘋果酸合成酶(Malate Synthase,MS)是一由GlcB基因編碼而成,在乙醛酸循環(huán)途徑中的關(guān)鍵限速酶之一,對結(jié)核桿菌維持其持留狀態(tài)起決定性作用,因此本研究以這一關(guān)鍵酶為研究對象。本文以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板,通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增該菌株的GlcB基因,并將測序正確的GlcB基因,克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+)中,取名為pET28-glcb。重組蘋果酸合成酶在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。本研究成功克隆表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌H37Rv蘋果酸合成酶酶基因,最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件確定為在溫度為20℃,IPTG終濃度為0.6 mM,誘導(dǎo)表達(dá)8 h,GlcB蛋白表達(dá)量達(dá)到最大。以鎳離子螯合型瓊脂糖凝膠親和層析柱純化異檸檬酸裂解酶重組蛋白,以含200 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液將目的蛋白洗脫下來,經(jīng)SDS-PAGE鑒定,獲得了純度較高的MS重組蛋白。采用超微量分光光度計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測418 nm處光吸收值的變化來計(jì)算MS的酶活性。最終計(jì)算結(jié)果酶活性為6.6μmol/(min·mg)。同時(shí),采用Discovery Studio 2.1模擬多肽與MS蛋白晶體(3S9I)進(jìn)行分子對接,最終對接結(jié)果確定以下兩條七肽鏈,命名及氨基酸序列分別為:3號:RMHSSYH;113號:PSREPPN。采用固相合成法合成以上兩條七肽鏈,經(jīng)質(zhì)譜檢測是正確的。將合成正確的兩條七肽鏈分別與蘋果酸合成酶作用,檢測所合成的肽對MS具有抑制作用,抑制作用的檢測結(jié)果為,113號肽對MS的抑制作用最強(qiáng),抑制率達(dá)到了68.01%;3號肽,抑制率為63.98%。本研究為新型肽類抗結(jié)核藥物的研究和發(fā)展提供了先導(dǎo)化合物,為新型抗結(jié)核藥物的篩選和進(jìn)一步的研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 Glcb 蘋果酸合成酶 表達(dá)特性 活性
【學(xué)位授予單位】：長春工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.911;Q78
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 緒論8-18
• 1.1 結(jié)核桿菌的簡介8-9
• 1.2 結(jié)合分枝桿菌持留性9-10
• 1.3 蘋果酸合成酶的簡介10-14
• 1.3.1 蘋果酸合成酶的編碼基因及蛋白結(jié)構(gòu)10-11
• 1.3.2 蘋果酸合成酶Glc B基因表達(dá)條件11-12
• 1.3.3 蘋果酸合成酶的催化機(jī)理12-13
• 1.3.4 金屬離子、p H值對蘋果酸合成酶酶活力的影響13
• 1.3.5 蘋果酸合成酶在乙醛酸循環(huán)過程中的作用13-14
• 1.4 多肽藥物的研發(fā)14-15
• 1.4.1 多肽藥物特點(diǎn)14
• 1.4.2 多肽藥物靶點(diǎn)14-15
• 1.5 抗結(jié)核病多肽藥物的研發(fā)15-16
• 1.5.1 抗結(jié)核多肽藥物靶點(diǎn)的研究現(xiàn)狀15-16
• 1.5.2 以蘋果酸合成酶為藥物靶點(diǎn)開發(fā)可能性16
• 1.6 藥物模擬篩選16-17
• 1.7 小結(jié)17-18
• 第二章 材料和方法18-35
• 2.1 主要材料18-20
• 2.1.1 試劑及儀器18-20
• 2.1.2 菌株及質(zhì)粒20
• 2.2 培養(yǎng)基與溶液配制20-21
• 2.3 H37RV菌株的培養(yǎng)21-22
• 2.4 基因組DNA提取22
• 2.5 PCR擴(kuò)增目的基因及回收純化22-25
• 2.5.1 引物設(shè)計(jì)22-23
• 2.5.2 PCR反應(yīng)體系及條件23
• 2.5.3 瓊脂糖凝膠電泳：23-24
• 2.5.4 目的基因回收、純化24-25
• 2.6 載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及篩選25-28
• 2.6.1 克隆載體的構(gòu)建26
• 2.6.2 表達(dá)載體的構(gòu)建26-27
• 2.6.3 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備27
• 2.6.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化27
• 2.6.5 重組質(zhì)粒的藍(lán)白斑篩選27-28
• 2.7 質(zhì)粒提取、純化及酶切鑒定28-30
• 2.7.1 堿法小量提取質(zhì)粒及純化28
• 2.7.2 堿法大量提取質(zhì)粒及純化28-29
• 2.7.3 質(zhì)粒的酶切鑒定29-30
• 2.8 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化30
• 2.8.1 IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化菌表達(dá)蘋果酸合成酶30
• 2.8.2 Glc B蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化30
• 2.9 Glc B蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化產(chǎn)物的鑒定30-32
• 2.10 GLCB蛋白的活性檢測32-33
• 2.11 分子對接模擬33
• 2.12 多肽合成、純化鑒定及其抑制檢測33-35
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-50
• 3.1 GLCB基因提取及測序鑒定35-38
• 3.1.1 提取結(jié)核分枝桿菌的基因組與設(shè)計(jì)Glc B基因PCR引物35
• 3.1.2 GlcB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果35-36
• 3.1.3 pUM-T質(zhì)粒與目的基因連接以及測序結(jié)果36-38
• 3.2 PET28A（+）-GLCB重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建38-39
• 3.2.1 pET-28a（+）-glcb重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果38-39
• 3.3 SDS-PAGE鑒定重組表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)果39-40
• 3.4 SDS-PAGE鑒定產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)條件40-43
• 3.4.1 不同誘導(dǎo)時(shí)間對MS表達(dá)的影響40-41
• 3.4.2 不同誘導(dǎo)劑濃度對MS表達(dá)的影響41-42
• 3.4.3 不同誘導(dǎo)溫度對MS表達(dá)的影響42-43
• 3.5 SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物存在形式43-44
• 3.6 目的蛋白純化條件優(yōu)化44-45
• 3.7 重組MS的酶活性測定45
• 3.8 分子對接結(jié)果45-47
• 3.9 肽的固相合成鑒定及抑制作用47-50
• 3.9.1 合成肽的純化及質(zhì)譜鑒定47-48
• 3.9.2 合成肽對MS抑制作用檢測48-50
• 第四章 討論50-54
• 第五章 結(jié)論54-55
• 致謝55-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 作者簡介62
• 攻讀碩士學(xué)位期間研究成果62

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