【摘要】：【背景】 漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）在我國主要引起腎綜合征出血熱（Hemorrhagicfever with renal syndrome，HFRS），該病危害極為嚴重，目前尚缺乏特效的治療藥物，主要使用疫苗進行預防。目前我國已成功研制HFRS滅活疫苗，其推廣使用對預防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用。但該類疫苗仍存在一些問題，主要是不能有效刺激細胞免疫應答，誘導機體產生中和抗體的能力也較弱，抗體滴度不高等，因而研發(fā)新型的HFRS疫苗成為當務之急。近年來，病毒樣顆粒（Virus-like Particle，VLP）疫苗由于其安全性好和免疫原性強的優(yōu)點使得其成為目前最有發(fā)展前景的新型基因工程候選疫苗之一。同時研究發(fā)現(xiàn)通過對VLP進行修飾，將細胞因子錨定到VLP表面使其成為嵌合VLP可以使其具有更好的免疫原性。本研究通過桿狀病毒表達載體系統(tǒng)（Baculovirus expression vector system，BEVS）分別表達HTNV包膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP）來構建HTNV VLP，同時表達糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）或CD40配體（CD40Ligand，CD40L），使之修飾在VLP表面，獲得了兩種HTNV嵌合VLP（VLP-GM-CSF，VLP-CD40L），并對其生物學活性和免疫學特性進行了研究，以期為進一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定理論和實驗基礎。 【方法】 將HTNV76-118株編碼GP的M基因和編碼NP的S基因以及小鼠的GPI-GM-CSF（以下簡稱GM-CSF）、CD40L基因分別克隆入BEVS中的pFastBacTMDual轉移載體中，構建各重組桿狀病毒（recombinant Baculovirus，rBV）轉移載體（pFastBacTMDual-M、pFastBacTMDual-S、pFastBacTMDual-GM-CSF、pFastBacTMDual-CD40L），酶切后瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，并進行序列測定。將構建好的各rBV轉移載體分別轉化大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）DH10BacTM后提取各rBV桿粒，即Bacmid-M、Bacmid-S、Bacmid-GM-CSF、Bacmid-CD40L，并利用PCR進行鑒定。將構建好的各rBV桿粒轉染sf9昆蟲細胞后獲得各rBV，分別命名為rBV-M、rBV-S、rBV-GM-CSF、rBV-CD40L。取各rBV感染sf9昆蟲細胞，利用間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescence assay，IFA）檢測各目的蛋白的表達。 將rBV-M、rBV-S以及rBV-GM-CSF或rBV-CD40L通過共感染sf9昆蟲細胞的方式分別制備各組VLP（VLP、VLP-GM-CSF、VLP-CD40L），在電鏡下觀察sf9昆蟲細胞內及培養(yǎng)上清中的各組VLP的組裝情況。分別大量制備和收集各組VLP，通過蔗糖密度梯度離心法純化各組VLP，并利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linkedimmunoadsordent assay，ELISA）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、蛋白質印跡法（Westernblot，WB）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）等方法進行鑒定。 在上述工作的基礎上，研究分析了各組VLP的生物學活性及免疫學特性。通過流式細胞術（Flow cytometry，F(xiàn)CM）分別檢測了各組VLP促小鼠骨髓細胞增殖能力、促小鼠骨髓細胞向樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）分化能力以及促B淋巴細胞活化能力。將各組VLP通過皮下注射途徑免疫C57BL/6小鼠，以添加外源重組細胞因子的VLP（VLP+GM-CSF、VLP+CD40L）、HFRS滅活疫苗以及PBS為對照。通過ELISA及微量細胞中和試驗分別檢測免疫后各組小鼠血清中抗HTNV GP及NP的特異性抗體及中和抗體的滴度，以反映各組小鼠的體液免疫應答的情況；通過酶聯(lián)免疫斑點試驗（Enzyme Linked Immunospot assay，ELISPOT）及細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）殺傷試驗分別檢測免疫后各組小鼠脾細胞分泌細胞因子的水平以及其CTL殺傷活性，以反映各組小鼠的細胞免疫應答的情況；取HTNV76-118株通過肌肉注射途徑接種各組免疫小鼠，通過ELISA及實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分別檢測接種后各組免疫小鼠臟器組織中HTNV抗原及核酸，通過蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色各組小鼠臟器組織并進行鏡檢，觀察接種后各組免疫小鼠臟器組織的病理學變化，以評價各組VLP預防接種對HTNV感染的保護作用。 【結果】 將各目的片段克隆入BEVS轉移載體后，酶切鑒定結果顯示，各rBV轉移載體均切出與相應目的基因大小相一致的核酸條帶；測序結果顯示，各目的基因序列正確，無突變產生，表明成功地構建了各rBV轉移載體。對重組桿粒PCR鑒定結果顯示，各rBV桿粒中均擴增出與預期大小相一致的核酸條帶，證實各組rBV桿粒構建正確。將各重組桿粒轉染昆蟲細胞獲得rBV，感染細胞后IFA檢測結果顯示，各組rBV均可表達相應的目的蛋白。 將各rBV共感染昆蟲細胞后，電鏡觀察結果顯示，在昆蟲細胞內及培養(yǎng)上清中均可清楚地觀察到直徑大小約為80~220nm的顆粒，初步判定為各組VLP。大量制備各組VLP，利用蔗糖密度梯度離心進行純化，離心結束后能夠清晰的觀察到各組VLP的聚集帶。SDS-PAGE及WB檢測各組VLP，結果發(fā)現(xiàn)各組VLP中均含有與相應目的蛋白大小相一致的特異性蛋白條帶。ELISA及Co-IP檢測結果顯示，在嵌合VLP中，GM-CSF或CD40L均成功地錨定在VLP上。 對各VLP進行生物學活性檢測的結果顯示，各組VLP均可刺激小鼠骨髓細胞的增殖和向DC的分化，并有效地促進了小鼠B淋巴細胞的活化，且VLP-GM-CSF的刺激能力要強于VLP-CD40L和VLP（p0.05）。對各VLP免疫小鼠進行免疫學活性檢測的結果表明，各組VLP均可刺激C57BL/6小鼠產生針對HTNV GP、NP的特異性抗體以及中和抗體，且VLP-CD40L和VLP-GM-CSF組抗體滴度均高于VLP組、滅活疫苗組，以及相應的外源細胞因子添加組VLP+CD40L、VLP+GM-CSF，其中VLP-CD40L組抗體滴度最高（p0.05）。在HTNV GP或NP刺激下，與PBS組相比，各組VLP均可增強小鼠脾細胞分泌IFN-γ和IL-2的水平，且VLP-CD40L、VLP-GM-CSF組小鼠脾細胞分泌IFN-γ和IL-2水平均高于VLP組、滅活疫苗組，以及相應的外源細胞因子添加組，其中VLP-CD40L組分泌水平最高（p0.05），而各免疫組小鼠脾細胞分泌IL-4和IL-10的水平無明顯差異（p0.05）。在HTNV GP或NP刺激下，與PBS組相比，各組VLP均可增強小鼠脾細胞的殺傷活性，且隨著效靶比（Effector cell/Target cell，E/T）的升高而增強。VLP-CD40L、VLP-GM-CSF組小鼠脾細胞殺傷活性在不同E/T時均高于VLP組、滅活疫苗組，以及相應的外源細胞因子添加組，其中VLP-CD40L組殺傷活性最高（p0.05）。 免疫小鼠保護實驗的結果顯示，PBS對照組小鼠的肝臟、脾臟和腎臟組織中的HTNV抗原檢測均為陽性，而其他各實驗組以及正常對照組小鼠的所有臟器組織均未檢測到HTNV抗原。RT-PCR檢測各組小鼠臟器中HTNV核酸的結果與病毒抗原結果結果相一致。HE染色鏡檢結果顯示，PBS組小鼠的脾臟中出現(xiàn)了彌漫性出血，淋巴細胞彌漫性浸潤以及白髓增多等病理學變化，而其他各實驗組以及正常對照組小鼠的所有臟器組織均未觀察到病理學變化。上述結果提示，HTNV能夠感染未經免疫的C57BL/6小鼠，而經各VLP免疫后能夠保護小鼠免受HTNV的攻擊。 【結論】 本研究通過BEVS表達系統(tǒng)獲得了嵌合有GM-CSF或CD40L的HTNV VLP，各嵌合VLP均具有有良好的生物學活性，同時嵌合在VLP表面的CD40L或GM-CSF有效地增強了其刺激機體產生特異性免疫應答的能力，且各項指標均優(yōu)于HFRS滅活疫苗組。免疫小鼠保護實驗結果證實嵌合VLP可以有效地保護C57BL/6小鼠免受HTNV的攻擊。本研究為進一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定了良好的理論、實驗和物質基礎。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2728011