【摘要】：【背景】 漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）在我國主要引起腎綜合征出血熱（Hemorrhagicfever with renal syndrome，HFRS），該病危害極為嚴(yán)重，目前尚缺乏特效的治療藥物，主要使用疫苗進(jìn)行預(yù)防。目前我國已成功研制HFRS滅活疫苗，其推廣使用對(duì)預(yù)防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用。但該類疫苗仍存在一些問題，主要是不能有效刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力也較弱，抗體滴度不高等，因而研發(fā)新型的HFRS疫苗成為當(dāng)務(wù)之急。近年來，病毒樣顆粒（Virus-like Particle，VLP）疫苗由于其安全性好和免疫原性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)使得其成為目前最有發(fā)展前景的新型基因工程候選疫苗之一。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)通過對(duì)VLP進(jìn)行修飾，將細(xì)胞因子錨定到VLP表面使其成為嵌合VLP可以使其具有更好的免疫原性。本研究通過桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（Baculovirus expression vector system，BEVS）分別表達(dá)HTNV包膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP）來構(gòu)建HTNV VLP，同時(shí)表達(dá)糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）或CD40配體（CD40Ligand，CD40L），使之修飾在VLP表面，獲得了兩種HTNV嵌合VLP（VLP-GM-CSF，VLP-CD40L），并對(duì)其生物學(xué)活性和免疫學(xué)特性進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【方法】 將HTNV76-118株編碼GP的M基因和編碼NP的S基因以及小鼠的GPI-GM-CSF（以下簡稱GM-CSF）、CD40L基因分別克隆入BEVS中的pFastBacTMDual轉(zhuǎn)移載體中，構(gòu)建各重組桿狀病毒（recombinant Baculovirus，rBV）轉(zhuǎn)移載體（pFastBacTMDual-M、pFastBacTMDual-S、pFastBacTMDual-GM-CSF、pFastBacTMDual-CD40L），酶切后瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行序列測(cè)定。將構(gòu)建好的各rBV轉(zhuǎn)移載體分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）DH10BacTM后提取各rBV桿粒，即Bacmid-M、Bacmid-S、Bacmid-GM-CSF、Bacmid-CD40L，并利用PCR進(jìn)行鑒定。將構(gòu)建好的各rBV桿粒轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞后獲得各rBV，分別命名為rBV-M、rBV-S、rBV-GM-CSF、rBV-CD40L。取各rBV感染sf9昆蟲細(xì)胞，利用間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescence assay，IFA）檢測(cè)各目的蛋白的表達(dá)。 將rBV-M、rBV-S以及rBV-GM-CSF或rBV-CD40L通過共感染sf9昆蟲細(xì)胞的方式分別制備各組VLP（VLP、VLP-GM-CSF、VLP-CD40L），在電鏡下觀察sf9昆蟲細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中的各組VLP的組裝情況。分別大量制備和收集各組VLP，通過蔗糖密度梯度離心法純化各組VLP，并利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linkedimmunoadsordent assay，ELISA）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot，WB）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）等方法進(jìn)行鑒定。 在上述工作的基礎(chǔ)上，研究分析了各組VLP的生物學(xué)活性及免疫學(xué)特性。通過流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）分別檢測(cè)了各組VLP促小鼠骨髓細(xì)胞增殖能力、促小鼠骨髓細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）分化能力以及促B淋巴細(xì)胞活化能力。將各組VLP通過皮下注射途徑免疫C57BL/6小鼠，以添加外源重組細(xì)胞因子的VLP（VLP+GM-CSF、VLP+CD40L）、HFRS滅活疫苗以及PBS為對(duì)照。通過ELISA及微量細(xì)胞中和試驗(yàn)分別檢測(cè)免疫后各組小鼠血清中抗HTNV GP及NP的特異性抗體及中和抗體的滴度，以反映各組小鼠的體液免疫應(yīng)答的情況；通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunospot assay，ELISPOT）及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）殺傷試驗(yàn)分別檢測(cè)免疫后各組小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平以及其CTL殺傷活性，以反映各組小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答的情況；取HTNV76-118株通過肌肉注射途徑接種各組免疫小鼠，通過ELISA及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分別檢測(cè)接種后各組免疫小鼠臟器組織中HTNV抗原及核酸，通過蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色各組小鼠臟器組織并進(jìn)行鏡檢，觀察接種后各組免疫小鼠臟器組織的病理學(xué)變化，以評(píng)價(jià)各組VLP預(yù)防接種對(duì)HTNV感染的保護(hù)作用。 【結(jié)果】 將各目的片段克隆入BEVS轉(zhuǎn)移載體后，酶切鑒定結(jié)果顯示，各rBV轉(zhuǎn)移載體均切出與相應(yīng)目的基因大小相一致的核酸條帶；測(cè)序結(jié)果顯示，各目的基因序列正確，無突變產(chǎn)生，表明成功地構(gòu)建了各rBV轉(zhuǎn)移載體。對(duì)重組桿粒PCR鑒定結(jié)果顯示，各rBV桿粒中均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相一致的核酸條帶，證實(shí)各組rBV桿粒構(gòu)建正確。將各重組桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞獲得rBV，感染細(xì)胞后IFA檢測(cè)結(jié)果顯示，各組rBV均可表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白。 將各rBV共感染昆蟲細(xì)胞后，電鏡觀察結(jié)果顯示，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中均可清楚地觀察到直徑大小約為80~220nm的顆粒，初步判定為各組VLP。大量制備各組VLP，利用蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化，離心結(jié)束后能夠清晰的觀察到各組VLP的聚集帶。SDS-PAGE及WB檢測(cè)各組VLP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組VLP中均含有與相應(yīng)目的蛋白大小相一致的特異性蛋白條帶。ELISA及Co-IP檢測(cè)結(jié)果顯示，在嵌合VLP中，GM-CSF或CD40L均成功地錨定在VLP上。 對(duì)各VLP進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè)的結(jié)果顯示，各組VLP均可刺激小鼠骨髓細(xì)胞的增殖和向DC的分化，并有效地促進(jìn)了小鼠B淋巴細(xì)胞的活化，且VLP-GM-CSF的刺激能力要強(qiáng)于VLP-CD40L和VLP（p0.05）。對(duì)各VLP免疫小鼠進(jìn)行免疫學(xué)活性檢測(cè)的結(jié)果表明，各組VLP均可刺激C57BL/6小鼠產(chǎn)生針對(duì)HTNV GP、NP的特異性抗體以及中和抗體，且VLP-CD40L和VLP-GM-CSF組抗體滴度均高于VLP組、滅活疫苗組，以及相應(yīng)的外源細(xì)胞因子添加組VLP+CD40L、VLP+GM-CSF，其中VLP-CD40L組抗體滴度最高（p0.05）。在HTNV GP或NP刺激下，與PBS組相比，各組VLP均可增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2的水平，且VLP-CD40L、VLP-GM-CSF組小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2水平均高于VLP組、滅活疫苗組，以及相應(yīng)的外源細(xì)胞因子添加組，其中VLP-CD40L組分泌水平最高（p0.05），而各免疫組小鼠脾細(xì)胞分泌IL-4和IL-10的水平無明顯差異（p0.05）。在HTNV GP或NP刺激下，與PBS組相比，各組VLP均可增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性，且隨著效靶比（Effector cell/Target cell，E/T）的升高而增強(qiáng)。VLP-CD40L、VLP-GM-CSF組小鼠脾細(xì)胞殺傷活性在不同E/T時(shí)均高于VLP組、滅活疫苗組，以及相應(yīng)的外源細(xì)胞因子添加組，其中VLP-CD40L組殺傷活性最高（p0.05）。 免疫小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，PBS對(duì)照組小鼠的肝臟、脾臟和腎臟組織中的HTNV抗原檢測(cè)均為陽性，而其他各實(shí)驗(yàn)組以及正常對(duì)照組小鼠的所有臟器組織均未檢測(cè)到HTNV抗原。RT-PCR檢測(cè)各組小鼠臟器中HTNV核酸的結(jié)果與病毒抗原結(jié)果結(jié)果相一致。HE染色鏡檢結(jié)果顯示，PBS組小鼠的脾臟中出現(xiàn)了彌漫性出血，淋巴細(xì)胞彌漫性浸潤以及白髓增多等病理學(xué)變化，而其他各實(shí)驗(yàn)組以及正常對(duì)照組小鼠的所有臟器組織均未觀察到病理學(xué)變化。上述結(jié)果提示，HTNV能夠感染未經(jīng)免疫的C57BL/6小鼠，而經(jīng)各VLP免疫后能夠保護(hù)小鼠免受HTNV的攻擊。 【結(jié)論】 本研究通過BEVS表達(dá)系統(tǒng)獲得了嵌合有GM-CSF或CD40L的HTNV VLP，各嵌合VLP均具有有良好的生物學(xué)活性，同時(shí)嵌合在VLP表面的CD40L或GM-CSF有效地增強(qiáng)了其刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力，且各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于HFRS滅活疫苗組。免疫小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)嵌合VLP可以有效地保護(hù)C57BL/6小鼠免受HTNV的攻擊。本研究為進(jìn)一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定了良好的理論、實(shí)驗(yàn)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2728011