【摘要】：Stra8(stimulated by retinoic acid gene8,Stra8),是視黃酸(retinoic acid,RA)誘導(dǎo)基因之一,對于減數(shù)分裂啟動和男性生殖發(fā)育具有重要作用。Stra8在正在分化的精原細(xì)胞到前細(xì)線期精母細(xì)胞表達。而且Stra8在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均具有定位,并根據(jù)發(fā)揮功能的不同在核質(zhì)之間穿梭。Stra8敲除小鼠不育,但其在精子發(fā)生中的作用及機制尚未闡明。本課題通過以下兩個部分研究Stra8在精子發(fā)生中的作用與機制:第一,Stra8在精子發(fā)生中抑制細(xì)胞凋亡機制的初步探索。第二,體外研究Stra8與Setd8的相互作用。該研究為揭示Stra8在精子發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ)。第一部分:Stra8在精子發(fā)生中抑制細(xì)胞凋亡機制的初步探索。(一)通過體內(nèi)和體外實驗,發(fā)現(xiàn)并鑒定Stra8在精子發(fā)生中具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。在Stra8 KO小鼠模型、維生素A缺乏小鼠(VAD)及VAD恢復(fù)小鼠(VAR)中發(fā)現(xiàn)Stra8具有抑制凋亡的作用。我們選擇11dpp的Stra8KO小鼠睪丸進行TUNEL實驗并計數(shù)凋亡細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與WT小鼠相比,Stra8KO小鼠生精細(xì)胞管內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加。其次,構(gòu)建維生素A缺乏和VAD恢復(fù)小鼠模型(VADandVAR)。通過TUNEL實驗發(fā)現(xiàn)在45天和61天的VAD小鼠模型中,凋亡細(xì)胞明顯增加,進一步驗證Stra8具有抑制凋亡作用。最后,在Stra8過表達精原細(xì)胞驗證了 Stra8抑制凋亡的作用,應(yīng)用TUNEL實驗和流式細(xì)胞術(shù)對凋亡細(xì)胞進行計數(shù),也發(fā)現(xiàn)在Stra8過表達精原細(xì)胞內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。(二)通過基因微陣列分析,探索Stra8抑制細(xì)胞凋亡的機制及相關(guān)通路。通過基因微陣列分析,我們發(fā)現(xiàn)了 5個上調(diào)基因和4個下調(diào)基因與細(xì)胞凋亡相關(guān)。通過qRT-QCR驗證與文獻查閱發(fā)現(xiàn),在這些DEGs中,PDK1(AKT重要上游因子)、ANG2(BCL2抑制因子)、USP33、TCF4、GSTP1(MAPK 相關(guān)因子)、OSGIN1(P53 相關(guān)因子)和 Caspase 3 與 AKT 信號通路相關(guān),同時 BCL2、P53、ERK(MAPK1/3)、JNK(MAPK8/9)和 P38(MAPK14)是AKT信號通路的關(guān)鍵因子。(三)Stra8在精子發(fā)生中抑制凋亡作用的潛在通路繪制。我們進一步在mRNA和蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,Stra8過表達精原細(xì)胞內(nèi)PDK1、AKT、BCL2和ERK的表達水平均明顯升高,P53 mRNA表達水平顯著降低,但其蛋白表達沒有明顯差別。同時,通過檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,Stra8過表達精原細(xì)胞內(nèi)Caspase 3在mRNA和蛋白水平均表達降低。因此,Stra8可能通過AKT通路直接或間接抑制P53或激活BCL2家族基因,與MAPK通路相互作用,進而抑制caspases家族基因,發(fā)揮抑制凋亡作用。第二部分:體外研究Stra8與Setd8的相互作用。(一)Stra8過表達精原細(xì)胞和P19細(xì)胞中Stra8、Setd8和H4K20me1的表達。應(yīng)用WB檢測Stra8過表達精原細(xì)胞內(nèi)Setd8和H4K20me1的表達發(fā)現(xiàn),與對照組相比,在Stra8過表達精原細(xì)胞中,Set8表達降低,而H4K20me1表達增高,提示三者之間可能具有相互調(diào)控關(guān)系。之后,我們應(yīng)用4μMRA誘導(dǎo)P19細(xì)胞36-48hr,使其瞬時過表達Stra8,然后檢測誘導(dǎo)后P19細(xì)胞內(nèi)Set8和H4K20me1的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與未誘導(dǎo)P19相比,RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化后,Set8表達水平降低,而H4K20me1表達增高,與在Stra8過表達精原細(xì)胞的表型一致,進一步驗證三者之間具有相互調(diào)控關(guān)系。(二)Stra8過表達細(xì)胞株的細(xì)胞周期同步化方法的建立。由于Stra8、Setd8和H4K20me1的表達與細(xì)胞周期相關(guān)。因此我們參照Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化方法,將Stra8過表達精原細(xì)胞同步化至細(xì)胞周期的不同階段。首先,應(yīng)用血清剝奪法同步化Stra8過表達精原細(xì)胞至G1期,分別血清剝奪培養(yǎng)細(xì)胞24,36,48,60,72,84,96hr,發(fā)現(xiàn)血清剝奪培養(yǎng)72hr后,細(xì)胞周期同步化至G1期效率最高,達60-70%。其次,應(yīng)用“二次胸苷(2.5mM)阻滯法”同步化Stra8-GC1至S期,第二次釋放時間分別為0,3,6,9hr,發(fā)現(xiàn)二次釋放時間3hr后細(xì)胞的S期同步化效率最好,達60-70%。最后,應(yīng)用100ng/ml諾考達唑分別處理4,8,12hr,發(fā)現(xiàn)處理8hr后細(xì)胞的M期同步化效率最好,達90%以上。(三)Stra8,Setd8和H4K20me1在Stra8過表達細(xì)胞株在細(xì)胞周期不同階段的表達。我們應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光和Western Bloting法檢測Stra8過表達精原細(xì)胞細(xì)胞周期不同階段Stra8,Setd8和H4K20me1的表達,發(fā)現(xiàn)在Stra8-GC1內(nèi),Stra8表達在G1期低,S期達到高峰,信號核質(zhì)均有,在G2/M期表達降低;Setd8表達在G1期無表達,在S期后期開始表達,信號主要在細(xì)胞核,在G2/M期表達水平達高峰;H4K20me1表達模式與Setd8表達相似。經(jīng)過表型分析與文獻查閱我們猜測在細(xì)胞周期S期中,Stra8抑制E3泛素連接酶相關(guān)基因表達,CRL4Cdt2,SCFSkp2等,減弱其對Set8的降解作用,導(dǎo)致Setd8總體表達下降;而由于H4K20me1提前表達,反而導(dǎo)致H4K20me1總體表達水平提高。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R321.1
【圖文】：

視野下選取完整較圓的生精小管，以生精小管為單位計數(shù)小管內(nèi)凋亡陽性細(xì)胞，計算凋逡逑亡細(xì)胞與正常生精細(xì)胞比例，每只小鼠至少計數(shù)１００個生精小管。通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)，野生型逡逑和Ｓｔｒａ８邋ＫＯ小鼠生精細(xì)胞管內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量較ＷＴ小鼠明顯增加（圖１Ａ）；凋亡細(xì)胞數(shù)分逡逑別是邋ＷＴ：０．１８±０．０６，邋Ｓｔｒａ８ＫＯ：邋０．４４±０．０１邋（圖邋１Ｂ，＊＊Ｐ＜０．０１）。逡逑？邋Ｉ邋＼！邋Ｉ邐ＯＡＰＩ邐：邋’邋＼ｌ邋Ｉ逡逑－廣邋ｎ逡逑■■■丨：：

本文編號：2726814