【摘要】：研究背景和目的：金黃色葡萄球菌中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的感染危害嚴重，目前臨床抗生素療法已法完全控制MRSA感染，疫苗研制迫在眉睫。MRSA致病能力主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲酶的能力，金黃色葡萄球菌耐熱性腸毒素(SE)，是引起人類食物中毒、全身炎癥反應(yīng)和膿毒癥休克的主要原因，其中SEB在MRSA各菌株中序列相對保守，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在小鼠模型研究中證實，SEB具有比其他抗原更好的體液應(yīng)答優(yōu)勢，人SEB單克隆抗體可預(yù)防MRSA感染常見的毒性休克綜合癥。然而，SEB本身為毒素，用于人體存在安全隱患，因此，失去毒性的重組SEB突變子(rSEB)可能是MRSA疫苗良好的候選抗原。研究表明，SEB的免疫保護作用主要來自于抗體應(yīng)答，而機體的免疫應(yīng)答多集中針對免疫優(yōu)勢表位，抗原引起的保護性應(yīng)答實質(zhì)是特異的保護性表位的應(yīng)答。因此，對SEB抗原中保護性免疫優(yōu)勢表位的鑒定，是解析MRSA感染中SEB應(yīng)答的具體機制和優(yōu)化基于SEB的MRSA疫苗設(shè)計的重要前提。 目前已報道的SEB的B細胞表位的研究較少，對SEB的免疫優(yōu)勢的B細胞表位的全面分析尚未見報道，基于SEB免疫優(yōu)勢表位的疫苗研究也未見報道。本課題目的是系統(tǒng)篩選并鑒定SEB的B細胞免疫優(yōu)勢表位，并分析相應(yīng)優(yōu)勢表位的生物學功能；構(gòu)建并表達涵蓋SEB的免疫優(yōu)勢及亞優(yōu)勢B細胞表位的多表位融合蛋白疫苗，并評價其在抗MRSA感染中的保護作用。 方法： 第一部分： SEB的B細胞免疫優(yōu)勢表位篩選及其功能鑒定 1．因SEB毒性與其超抗原活性密切相關(guān)，為評價重組SEB突變子(rSEB)的毒性，用不同濃度的rSEB或天然SEB毒素分別刺激BALB/c小鼠脾淋巴細胞，分析rSEB刺激T細胞異常增殖及刺激脾淋巴細胞分泌IL-2，IFN-γ及TNF-α的能力。 2．用AlPO4佐劑輔助SEB突變子(rSEB)免疫BALB/c小鼠，在三次免疫之后進行MRSA252菌株的尾靜脈攻毒實驗，分析rSEB蛋白疫苗在預(yù)防MRSA252感染中的效果，并采集rSEB免疫后小鼠的血清，分析血清中SEB抗體效價，評價SEB抗體應(yīng)答在MRSA感染中的作用。 3．合成覆蓋SEB全長的42條重疊18-肽，以上步獲得的SEB抗血清為一抗，用肽ELISA法分析各個重疊18-肽與SEB的結(jié)合能力，系統(tǒng)篩選與SEB具有優(yōu)勢結(jié)合能力的線性B細胞表位肽。以SEB全蛋白作為陽性對照，以無關(guān)肽OVA192-201和無關(guān)蛋白BSA作為陰性對照。用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0作非配對T檢驗來分析各個吸光度值。 4．在弗氏佐劑輔助下，用免疫優(yōu)勢18-肽-KLH的偶聯(lián)物免疫BALB/c小鼠，經(jīng)三次免疫后獲得表位肽抗血清。以SEB天然毒素為包被抗原，用間接ELISA法檢測不同稀釋度的表位特異性抗血清與SEB天然毒素的結(jié)合能力。 5．針對每個已篩選出的SEB免疫優(yōu)勢表位，從N-端及C-端分別依次截斷2個氨基酸，合成多個截斷肽，分別以截斷肽為包被抗原，以相應(yīng)優(yōu)勢表位肽抗血清為一抗，用間接ELISA法分析各個截斷肽與相應(yīng)18-肽抗血清的結(jié)合強度,明確所篩選表位的核心序列。進一步，表位肽抗血清以不同濃度稀釋，再次用ELISA法篩選與相應(yīng)抗血清結(jié)合最強的截斷肽，即優(yōu)勢表位核心序列。 6．在動物模型中獲得表位核心序列的抗血清，在體外進行SEB毒素中和實驗，明確所篩選的SEB免疫優(yōu)勢表位的功能。在弗氏佐劑輔助下，用免疫優(yōu)勢表位核心序列-KLH偶聯(lián)物免疫BALB/c小鼠，經(jīng)末次免疫后7天獲得表位核心序列的抗血清，在體外分析該表位核心序列的抗血清阻斷SEB毒素的刺激T細胞增殖及脾淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ及TNF-α的能力。 7．在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索不同金黃色葡萄球菌菌株來源的SEB氨基酸序列，NCBI網(wǎng)站上進行同源性比對，明確所篩選的SEB優(yōu)勢表位在不同金黃色葡萄球菌菌株中的序列保守性。在Pubmed protein data base數(shù)據(jù)庫中下載SEB晶體結(jié)構(gòu)圖，用PyMOL1.1軟件分析SEB免疫優(yōu)勢表位在SEB晶體結(jié)構(gòu)中的位置，分析SEB免疫優(yōu)勢表位在SEB晶體結(jié)構(gòu)中的位置。 8．采用肽ELISA法分析SEB優(yōu)勢表位與臨床MRSA(+)血清的交叉反應(yīng)性，以此評價SEB優(yōu)勢表位在人體中的應(yīng)用前景。以SEB的優(yōu)勢表位為包被抗原以SEB抗血清為陽性對照，以臨床SEB抗體(-)血清為陰性對照。 第二部分：SEB的多表位疫苗制備及其保護功能評價 1．利用基因工程技術(shù)構(gòu)建含SEB優(yōu)勢表位及亞優(yōu)勢表位的疫苗蛋白的原核表達質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達重組SEB多表位融合蛋白；用SDS-PAGE鑒定蛋白該表達形式；用Western Blot分析該蛋白的免疫原性及免疫反應(yīng)性；經(jīng)離子交換層析純化該蛋白；對蛋白進行進行N端氨基酸測序；用BCA法檢測蛋白濃度。 2．分別在弗氏佐劑及AlPO4佐劑輔助下，用SEB多表位蛋白或rSEB免疫BALB/c小鼠，三次免疫后經(jīng)尾靜脈對小鼠進行MRSA252菌株攻毒，分析不同免疫組小鼠在MRSA252感染后14天的生存狀態(tài)，評價該疫苗對小鼠抗金黃色葡萄球菌感染的保護效果。 3．用ELISA法檢測小鼠的抗血清滴度，分析各組疫苗免疫后特異性抗體的效價。ELISA法檢測SEB多表位疫苗的血清中抗SEBIgG抗體的水平，評價SEB多表位疫苗抗體應(yīng)答在中和SEB毒素中的作用。分別以疫苗中的各個表位為包被抗原，ELISA法檢測疫苗的抗血清與疫苗中每個表位的結(jié)合強度，評價疫苗中每個表位特異性抗體的應(yīng)答水平。 4．無菌收集不同免疫組存活小鼠的心、肝、肺及腎臟，研磨獲得各臟器組織的懸液，選用生理鹽水作不同稀釋度稀釋，進行細菌涂板，通過菌落計數(shù)、革蘭染色及PCR法計算各臟器中MRSA252的數(shù)量，評價在免疫攻毒后小鼠各臟器中細菌的定植量。 結(jié)果： 第一部分：SEB的B細胞免疫優(yōu)勢表位篩選及其功能鑒定 1．SEB突變子(rSEB)失去了SEB天然毒素的超抗原活性，不能刺激T細胞異常增殖，也不能刺激脾淋巴細胞分泌高水平的細胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α。 2．用AlPO4佐劑輔助rSEB免疫BALB/c小鼠，獲得了預(yù)防MRSA252感染的效果，產(chǎn)生了高水平的針對天然SEB的抗體。小鼠存活率達80%，顯著高于AlPO4佐劑組(20%)及PBS組(全部死亡)。免疫后血清中SEB抗體平均效價高達1:64000，顯著高于AlPO4佐劑組及PBS組。 3．在SEB的應(yīng)答中，IgG抗體應(yīng)答主要集中針對其中三個免疫優(yōu)勢B細胞18-肽，包括SEB97-114(NKNIDLFGTNYYYQCYFS), SEB205-222(YETGYIKFIEGNGHSFWY)及SEB247-261(VESKSINVEVHLTKK)。其中SEB97 114及SEB247-261分別含有已報道表位SEB252-261(INVEVHLTKK)和SEB96-103(KNKNIDLF)，因此，SEB205-222為本研究新發(fā)現(xiàn)的表位。 4．與正常血清作對照，SEB的三個優(yōu)勢表位肽特異性抗血清在不同稀釋度下，均能高效與SEB天然毒素進行反應(yīng)(P＜0.05)，尤其在抗血清稀釋度為1:1000和1:2000時最顯著(P＜0.01)。 5．經(jīng)截斷肽ELISA及抗血清的濃度滴定法進一步檢測，在SEB97 114組截斷肽中，SEB97 112相比其他截斷肽與Anti-SEB97 114的結(jié)合能力最強；在SEB205 222組截斷肽中，SEB205 222相比其他截斷肽與Anti-SEB205 222的結(jié)合能力最強；在SEB247 261組截斷肽中，SEB247 261相比其他截斷肽與Anti-SEB247 261的結(jié)合能力最強。因此，免疫優(yōu)勢表位SEB97 114、SEB205-222及SEB247-261的核心序列分別為SEB97 112、 SEB207-222及SEB247-257。 6．在體外，SEB三個免疫優(yōu)勢表位的抗血清Anti-SEB97 114、Anti-SEB205-222及Anti-SEB247-261均可中和天然SEB毒素的刺激T細胞異常增殖及刺激脾淋巴細胞分泌高水平的細胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α的能力。 7．同源性分析顯示，SEB97 112及SEB207-222氨基酸序列保守，SEB247-257氨基酸序列非保守；三維晶體結(jié)構(gòu)圖中顯示，SEB97 112位于SEB內(nèi)部的Loop區(qū)，SEB207-222及SEB247-257SEB外部的β-片層。 8．SEB97-112與14/14的人MRSA(+)血清有交叉反應(yīng)，SEB207-222與13/14的人MRSA(+)血清有交叉反應(yīng)，SEB247-257與14/14的人MRSA(+)血清有交叉反應(yīng)。 第二部分：SEB的多表位疫苗制備及其保護功能評價 1．構(gòu)建并獲得了含SEB三個優(yōu)勢表位及三個亞優(yōu)勢表位的SEB多表位融合蛋白。經(jīng)鑒定，該蛋白為包涵體表達，經(jīng)純化后的蛋白純度大于95%，SEB多表位融合蛋白具有良好的免疫原性及免疫反應(yīng)性， SEB多表位融合蛋白的N端氨基酸序列與目的蛋白一致。經(jīng)純化的SEB多表位融合蛋白濃度為2.924mg/mL。 2．分別在弗氏佐劑及AlPO4佐劑輔助下，用SEB多表位融合蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠，免疫三次后小鼠獲得了對MRSA252的抗感染保護能力。SEB多表位融合蛋白疫苗組的免疫保護效果優(yōu)于rSEB全抗原組的免疫保護效果，尤其在AlPO4佐劑輔助下，表位疫苗組小鼠抗MRSA252感染的存活率高達100%。 3．SEB多表位融合蛋白疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了高效價的抗體，特別是在AlPO4佐劑下，SEB多表位融合蛋白疫苗組產(chǎn)生的抗體平均效價高達1:736000。SEB多表位融合蛋白疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體能夠識別天然SEB毒素，在不同佐劑輔助時，SEB多表位疫苗產(chǎn)生的抗SEB IgG抗體水平有差異。該SEB多表位融合蛋白疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體在不同程度上特異性地識別了各個表位，且各個表位的協(xié)同可能發(fā)揮更好的抗MRSA感染的作用。 4．免疫攻毒后，存活小鼠的各個臟器中，腎臟定植的MRSA細菌量顯著高于心、肝、肺。經(jīng)統(tǒng)計學分析，小鼠抗MRSA感染存活率與各個臟器細菌定植量成負相關(guān)。 結(jié)論： 本實驗通過重疊肽ELISA、B細胞表位特異性抗體的中和毒素活性試驗、抗原表位的生物信息學及臨床血清學分析，篩選并鑒定出了SEB的三個免疫優(yōu)勢應(yīng)答B(yǎng)細胞表位，揭示了SEB體液免疫在抗MRSA感染中的保護機制，不僅發(fā)現(xiàn)了SEB的新表位SEB207-222，而且揭示了已報道的SEB表位的核心序列SEB97-112及SEB247-257。通過基因工程技術(shù)構(gòu)建并獲得了SEB多表位疫苗，進一步通過該疫苗的動物保護實驗，并證明了SEB的多表位融合蛋白疫苗具有顯著的預(yù)防和清除MRSA感染的免疫保護作用，為MRSA疫苗提供了新的研究思路和設(shè)計策略
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【參考文獻】

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2 李江濤;殷相平;張金衛(wèi);丁農(nóng);柳紀省;;狂犬病病毒CVS株糖蛋白、核蛋白生物信息學分析[J];生物技術(shù)通報;2010年07期

本文編號：2726608