【摘要】：第一部分：北蟲草菌絲、子實體的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析 冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)是中國傳統(tǒng)的藥用真菌,是寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體,許多研究證明其有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生理作用。天然的蟲草稀少且昂貴,資源也日益枯竭。北蟲草(Cordyceps militaris)是蟲草屬的另一種蟲、菌結合的藥用真菌,活性成分與冬蟲夏草類似,其己經(jīng)被成功的進行了人工栽培并作為天然蟲草的替代品被廣泛接受。但是除了蟲草素、蟲草酸和蟲草多糖等常見的活性組分,對北蟲草中其他藥用組分特別是蛋白組分的研究較少。本研究從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對不同發(fā)育階段的人工培養(yǎng)北蟲草進行了系統(tǒng)的分子學研究,以期待發(fā)現(xiàn)活性蛋白質(zhì)／多肽成分。 我們對人工培養(yǎng)的北蟲草的菌絲及子實體進行了高通量的Illumina測序并進行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析。將得到的clean reads與己知的北蟲草基因組進行比對并進行序列隨機性評估和覆蓋率統(tǒng)計,結果顯示約有90%的clean reads能比對到北蟲草基因組上,且reads在基因個部位的分布均勻,基因覆蓋率大于90%,表明測序以及比對結果都較好。我們預測了共738個可變剪接事件以及不同時期的約3000個新的轉(zhuǎn)錄本,該預測豐富了北蟲草的數(shù)據(jù)庫。對北蟲草不同發(fā)育時期基因表達差異分析表明,共有2113個基因在菌絲時期高表達,有599個在子實體時期高表達。將這些差異表達基因進行功能注釋分析(GO, KEGG),發(fā)現(xiàn)與細胞內(nèi)核酸結合及代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等活動在菌絲時期較為活躍：而糖水化合物代謝,信號轉(zhuǎn)導等活動在子實體時期更為活躍。這都與北蟲草的發(fā)育需要相關。另外,我們通過對預測的蟲草素代謝途徑進行深入分析證明菌絲時期此代謝途徑更為活躍,這為蟲草素的生產(chǎn)優(yōu)化提供了數(shù)據(jù)支持。 我們利用一維凝膠電泳技術、高效液相色譜與質(zhì)譜結合技術對北蟲草的菌絲及子實體進行了蛋白質(zhì)組的測序。在菌絲和子實體中分別鑒定了359和214個蛋白,進行功能注釋分析(GO, KEGG, COG)后發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄組相似的規(guī)律,驗證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。另外,我們分析了其中值得關注的一些蛋白質(zhì),包括凝集素,超氧化物歧化酶,與蟲草素代謝途徑相關的酶等,為進一步研究北蟲草蛋白提供了重要數(shù)據(jù)信息。 根據(jù)北蟲草蛋白組數(shù)據(jù),我們從北蟲草菌絲或是子實體中進行基因克隆后原核表達了三個蛋白質(zhì)RicinB-related lectin (CCM_03832), ConA-like lectin (CCM_03227)和Superoxide dismutase (CCM_04979)o對它們進行生物活性分析,發(fā)現(xiàn)RicinB-related lectin (CCM_03832)有一定的凝血活性,RicinB-related lectin(CCM_03832)和ConA-like lectin (CCM_03227)能抑制HepG2細胞增殖,這三種蛋白都能刺激小鼠脾臟淋巴細胞的激活。 另外我們利用蛋白質(zhì)分離技術從北蟲草子實體中天然純化了三種蛋白CM-1, CM-2, CM-3,并通過質(zhì)譜技術在北蟲草數(shù)據(jù)庫中找到其對應序列,其生物活性也正在研究中。 第二部分：楊樹菇凝集素2,AAL-2(Agrocybe aegerita Lectin2)用于富集O-GlcNAc修飾蛋白/肽段及其檢測方法研究 O-GlcNAc修飾是非常重要的蛋白翻譯后修飾,它與磷酸化,泛素化,甲基化等一系列蛋白修飾相互作用,共同調(diào)節(jié)細胞的各種生理活動并參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。但是O-GlcNAc修飾的富集與鑒定是該領域的瓶頸問題。 我們研究組從大型真菌楊樹菇(Agrocybe aegerita)分離到一種新的凝集素AAL-2,通過糖譜鑒定發(fā)現(xiàn)其對GlcNAc具有極高的親和力和特異性,要遠遠高于常用于O-GlcNAc修飾肽段富集的麥胚凝集素WGA。 本研究中我們用AAL-2分別對簡單標準肽段樣品以及一個具有O-GlcNAc修飾的陽性蛋白進行O-GlcNAc修飾肽段的富集,并通過MALDI-MS檢測到了陽性肽段,證明AAL-2能有效富集簡單樣品中的O-GlcNAc修飾肽段。進一步,我們采用不同的層析方法對復雜樣品的肽段和蛋白進行了富集分析：對復雜肽段(包括B16-BL6細胞質(zhì)蛋白酶解肽段,糖尿病大鼠肝臟蛋白酶解肽段)進行富集,LC-MS/MS檢測結果表明O-GlcNAc修飾肽段在穿透尾部富集；對復雜蛋白(正常及糖尿病大鼠肝臟蛋白)進行富集,western和LC-MS/MS (CID)結果均表明,O-GlcNAc修飾蛋白對Sepharose4B-AAL2有更高的親和力,從而在洗脫峰中被富集。最后利用LC-MS/MS (ETD)技術從B16-BL6細胞質(zhì)樣品中鑒定到79個O-GlcNAc修飾蛋白(73個在穿透尾部檢測到,9個在洗脫中檢測到,其中有3個在兩部分中均能檢測到),共123個O-GlcNAc修飾位點(111個在穿透尾部檢測到,13個在洗脫中檢測到,其中有1個位點在兩部分中均能檢測到)。另外從糖尿病大鼠肝臟中檢測到99個O-GlcNAc修飾蛋白,共119個修飾位點,從普通大鼠肝臟中檢測到66個O-GlcNAc修飾蛋白,共82個修飾位點。這些結果還需要進一步的實驗驗證,本實驗初步建立了AAL-2富集O-GlcNAc修飾蛋白／肽段的方法。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378;S567.35
【圖文】：

法國農(nóng)業(yè)科學研究院（French National Institute for Agricultural Research, INRA ),中國華大基因（BGI)等也陸續(xù)的啟動了對大型真菌基因組的測序計劃。圖1-1列出了一些大型真菌和部分其他真菌的基因組測序年代表。部分其他真菌 大《真菌1996 ? 19962001 白色念 20012002 -— 2002I~衍箱械抱滿{~ crassa)??. 新��！^球保(C.neoftVTP) , 2003 ? 以鬼><c.c杝 ? 2003I_ 構絕丨Hi 哲ntHulans)2004 ?— tt?孢說 ￡平?閑[P chrysosponum) —? 2004I 里氏木資(T-reesei)2005 米丨丨丨丨播 2005■煙丨丨fl 每{A fumigatus)2006 niger) —? 2006L 級"f；輯(7* virens)AS綠木笛（r.afrcmri州 《色姥科（t f)咖M 20072008 ?— 石舞樣節(jié)皮聞("fl.肝pseum) —? 2008裂 Ww (S-coffimone)—-2009 「itiLfAM__tococcs> 服^ 2009‘ 洗W臥孔閑故金銀耳(rmesemertca)~~lC：勤閑{S.hirsutum) ~|松牛?擬?孔滿(F.pinicola)2010 ? W物內(nèi)卞.閣（e.fesfucae) p,抱塊閑(了TOtonosporu叫 _? 2010云芝AT.versicotof)僅等(W.cocos)」2011 小麥'：；^針泡D| (M.gram,n,cola) ] ? 20112012 *— 蟲擬站(C jl^iGanoderma 印.）~| ? 201?靈芝(G. Iucidum)~' ‘y ‘2013 ?— K 米小斑^^1p

本文編號：2725868