【摘要】：腎臟是藥物代謝和排泄的重要器官,由于其特殊的結(jié)構(gòu)和功能,對藥物的毒性作用極具易感性。藥物腎毒性已成為臨床前藥物中止研發(fā)和臨床不良反應(yīng)的主要原因。據(jù)估計(jì),藥物造成的腎損傷占所有急性腎損傷病例中的19-25%。如何及時(shí)、準(zhǔn)確、快速地評價(jià)腎毒性已成為藥物研發(fā)中的一個重要問題。目前診斷腎損傷最常用的指標(biāo)為血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN),但由于腎臟強(qiáng)大的代償作用,在發(fā)生輕微損傷時(shí)其變化往往不明顯,缺乏靈敏度和特異性。因此,為了探求在臨床前研究中更為靈敏、可靠的腎毒性早期預(yù)測指標(biāo),本研究分別采用硫酸慶大霉素建立了Wistar大鼠及Beagle犬的急性腎損傷模型,針對國際組織及臨床上最新提出的一系列潛在的腎毒性生物標(biāo)志物進(jìn)行了敏感性和特異性的評價(jià),并對大鼠尿液中的microRNA (miRNA)表達(dá)譜進(jìn)行了差異分析,以期找到能夠早期預(yù)測腎損傷的miRNA標(biāo)志物。 通過對大鼠腹腔注射60和120mg/kg硫酸慶大霉素,每天給藥1次,連續(xù)給藥10天,建立了大鼠腎損傷模型。體重檢測結(jié)果顯示,在連續(xù)給藥第10天,慶大霉素給藥組動物的體重呈現(xiàn)降低趨勢,并具有一定劑量相關(guān)性；與對照組相比,120mg/kg組動物的腎臟重量自第8天開始持續(xù)增加,60mg/kg組動物腎臟重量在給藥第11天后也表現(xiàn)增加的趨勢,表明了腎臟重量的變化與給藥時(shí)間及劑量具有一定的相關(guān)性。組織病理學(xué)分析結(jié)果證實(shí)隨給藥劑量及給藥時(shí)間的增加,慶大霉素給藥組動物出現(xiàn)腎小管細(xì)胞壞死損傷的動物數(shù)增加,且病變程度也隨之加重。尿液生物標(biāo)志物分析結(jié)果表明,低、高劑量組動物給藥后,尿液中腎損傷分子-1(Kim-1)叢生蛋白(Clusterin)、白蛋白(Albumin)、β2微球蛋白(B2M)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)升高幅度遠(yuǎn)高于BUN和Cr,個體分析數(shù)據(jù)也表明這些標(biāo)志物水平的增長與病理損傷具有較好的對應(yīng)關(guān)系,受試者操作特性曲線(ROC)結(jié)果證實(shí)這5種標(biāo)志物的曲線下面積(AUC)均明顯高于BUN、Cr,表現(xiàn)出了明顯優(yōu)于BUN和Cr的腎損傷診斷效能,具有更高的靈敏度和特異性,在藥物的大鼠臨床前安全性研究中具有良好的應(yīng)用前景。N-乙酰-p-D-葡萄糖苷酶(NAG)、血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Cys C)和表皮細(xì)胞生長因子(EGF)無論Inclusion還是Exclusion ROC分析的AUC均高于BUN及Cr,其診斷腎損傷的效能優(yōu)于BUN及Cr,但不及Kim-1等明顯。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、酸性糖蛋白(AGP)、堿性磷酸酶(ALP)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(Timp-1)、血管非炎性蛋白-1(Vanin-1)、鈣結(jié)合蛋白(Calbindin)、乳酸脫氫酶(LDH),這些標(biāo)志物ROC分析的AUC相當(dāng)或略低于BUN及Cr,對急性腎損傷診斷有一定診斷效能,但與比BUN與Cr相比無明顯優(yōu)勢。白介素18(IL-18)和骨橋蛋白(OPN)未表現(xiàn)出對大鼠急性腎損傷的診斷價(jià)值。 采用TaqMan(?) Array Rodent MicroRNA Cards對第8天對照組和60mg/kg、120mg/kg以及第4天120mg/kg組的動物尿樣進(jìn)行niRNA表達(dá)譜分析。通過對比分析第8天60mg/kg和120mg/kg組出現(xiàn)顯著變化的miRNA,以及120mg/kg組第4天和8天出現(xiàn)顯著變化的miRNA,共發(fā)現(xiàn)兼具時(shí)間和劑量相關(guān)性的32個上調(diào)miRNA及14個下調(diào)miRNA。以腎小管變性、壞死的組織病理損傷作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn),通過ROC分析初步篩選出上調(diào)niR-16-1-3p、345-5p、539、24-3p、466k、99b-3p、489和140-3p以及下調(diào)miR-1961、363、367、590-5p、215和451可能作為預(yù)測大鼠腎損傷潛在的生物標(biāo)志物,并且這些miRNA的變化有可能早于組織病理學(xué)損傷的出現(xiàn)。但這些niRNA的診斷價(jià)值、可能作用的通路及其與腎損傷相關(guān)的機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究確認(rèn)。 在應(yīng)用80mg/kg慶大霉素給藥劑量,連續(xù)給藥9天誘導(dǎo)的Beagle犬急性腎毒性模型上我們評估了尿液NGAL、Clusterin、NAG和尿總蛋白(uTP)的腎毒性診斷性能。結(jié)果表明,尿NGAL和Clusterin濃度分別在犬肌肉注射慶大霉素第1和3天后顯著升高,表現(xiàn)出明顯的時(shí)間相關(guān)性,且個體動物尿液中NGAL和Clusterin水平變化與其組織病理損傷具有良好的相關(guān)性,ROC分析的AUC均為1.000,證實(shí)NGAL和Clusterin在犬中診斷早期腎損傷的效能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)血清標(biāo)記物BUN和Cr,具有優(yōu)越的特異性和靈敏度。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果也表明生物標(biāo)志物NGAL和Clusterin基因在動物發(fā)生腎損傷后表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步提供數(shù)據(jù)支持這兩種生物標(biāo)志物預(yù)測腎毒性的特異性。此外,盡管尿NAG水平在動物出現(xiàn)腎損傷后濃度升高幅度不如NGAL和Clusterin,但其活性的升高與給藥次數(shù)及時(shí)間也表現(xiàn)出良好的相關(guān)性,具有較高的靈敏度,ROC分析結(jié)果也表明其靈敏度和特異性要優(yōu)于BUN。本研究發(fā)現(xiàn)uTP也有一定腎毒性診斷效能,但對急性腎損傷的早期診斷劣于NGAL、 Clusterin和NAG,與BUN及Cr相比無明顯優(yōu)勢。這些結(jié)果為未來尿生物標(biāo)志物應(yīng)用于藥物的Beagle犬臨床前安全性研究奠定了基礎(chǔ)。 腸道病毒71型(EV71)是一種無包膜的單股正鏈RNA病毒,是引起嬰幼兒手足口病(HFMD)的主要病原體之一。近年來,EV71感染引起的HFMD在多個國家呈周期性暴發(fā),并且不斷擴(kuò)散,已成為全世界,尤其是亞太地區(qū)的重要公共衛(wèi)生問題,對當(dāng)?shù)氐膬和】翟斐蓸O大地威脅。由于目前并沒有有效治療EV71感染的抗病毒藥物,免疫接種疫苗是預(yù)防和控制該病毒傳播的最有效方法。因此,為了推動EV71滅活疫苗早日進(jìn)入人體臨床試驗(yàn),本研究應(yīng)用Wistar大鼠和食蟹猴兩種動物,在臨床前系統(tǒng)地評價(jià)了EV71疫苗的安全性。 研究內(nèi)容主要包括大鼠肌肉注射EV71滅活疫苗急性毒性研究及大鼠和食蟹猴肌肉注射EV71滅活疫苗的重復(fù)給藥毒性研究。在大鼠重復(fù)給藥毒性研究中,動物于0、2、4、6周肌肉注射給予EV71疫苗進(jìn)行免疫,包括160U/只和320U/只兩個劑量,按體重折算,約800U/kg和1600U/kg(大鼠體重按200g計(jì)),分別約為臨床擬用劑量(320U/人,按兒童平均體重10～20kg計(jì)為16～32U/kg)的25～50倍和50～100倍；此外,還增設(shè)了單獨(dú)疫苗佐劑組。在食蟹猴重復(fù)給藥毒性研究中,動物也同樣于0、2、4、6周肌肉注射免疫,分別給予320U/只和1280U/只。按照人份計(jì)算,低、高劑量為臨床擬用劑量的1和4倍；按照體重折算,低、高劑量分別相當(dāng)于臨床擬用劑量的3.3～6.7倍和13.3～26.8倍。 急性毒性研究結(jié)果顯示大鼠單次肌肉注射大劑量EV71疫苗(640U/只)后,動物耐受性良好,臨床癥狀未見明顯異常,體重增長未見影響。給藥后15天,大體病理學(xué)檢查均未見明顯異常,表明大鼠單次給藥的無明顯毒性反應(yīng)劑量(NOAEL)為640U/只。Wistar大鼠和食蟹猴重復(fù)給藥毒性研究證實(shí)重復(fù)肌肉注射EV71疫苗后,在這兩種種屬動物中,除檢測發(fā)現(xiàn)血液中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞數(shù)量及比例在背景范圍內(nèi)的輕微變化以外,并沒有觀察到明顯的與注射EV71疫苗相關(guān)的系統(tǒng)性毒性反應(yīng),血清中也未檢出抗核抗體。組織病理學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予EV71疫苗的大鼠和食蟹猴的注射部位均出現(xiàn)了輕至重度的肌纖維變性、炎性細(xì)胞浸潤、肉芽腫等炎癥相關(guān)的病理學(xué)改變,這些病變隨時(shí)間延長逐漸減輕。此外,大鼠重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中設(shè)置的鋁佐劑對照組動物,也發(fā)現(xiàn)類似的組織病理學(xué)改變。這些結(jié)果表明上述組織病理變化與反復(fù)肌肉注射含有鋁佐劑疫苗引起的機(jī)械性損傷和炎癥刺激有關(guān)。此外,血清中和抗體檢測結(jié)果顯示大鼠和食蟹猴在接受第二次EV71疫苗接種后,動物血清的中和抗體均達(dá)到陽轉(zhuǎn)水平,表明在本研究供試品EV71滅活疫苗具有良好的免疫原性�？傊�,通過在Wistar大鼠和食蟹猴兩種動物種屬中系統(tǒng)的評價(jià)EV71滅活疫苗的安全性,證實(shí)了該EV71疫苗具有良好耐受性,未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng),可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的中和抗體反應(yīng),這些結(jié)果支持該產(chǎn)品可進(jìn)入下一階段—Ⅰ期臨床試驗(yàn)。同時(shí)這些研究數(shù)據(jù)也將有助于EV71滅活疫苗在臨床試驗(yàn)階段中劑量水平的確定以及免疫接種策略的制定。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【圖文】：

與對照組相比，第8天時(shí)120mg/kg組動物的腎臟重量增加了 22.2% (尸<0.05)，第11天時(shí)120mg/kg組動物腎臟重量增加更為明顯，比對照組增加了 40.0%(P<0.01)，同時(shí)腎臟的相對重量也顯著增加（圖1-1-1)。60mg/kg組動物腎臟重量在第11天時(shí)比對照組略有增加，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1-1-3)。腎臟重量的變化與給藥時(shí)間及劑量具有一定的相關(guān)性。 表1-1-3 Wistar大鼠連續(xù)腹腔注射慶大霉素對腎臟重量的影響（g, Mean±SD) _ 劑量指標(biāo) 給藥2天 給藥4天 給藥8天 給藥11天 (mg/kg) 0 2.58±0.24 2.36 士0.19 2.25士 0.11 2.45 土 0.19腎臟重量60 2.45±0.21 2.44±0.19 2.45士0.14 2.77士 0.31(g) 2.48 士0.24 2.43土 0.31 2.75 士0.47* 3.38士 0.50**0 8.6 士 0.9 7.5±0.5 7.1 士 0.3 7.1 土 0.7腎臟/體重60 8.1±0.8 7.7 士 0.5 7.6±0.4 8.2 土 0.9(g/kg) ^ 8.2±0.7 7.8 土 0.9 8.5±1.5 10.7 土 1.8**注：與同期對照組相比，*P<0.05, **P<0.01。Organ Weights of Kidney Relative organ weights of Kidney

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博N?畢業(yè)論義 組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示（圖1-1-2)，動物給藥后出現(xiàn)的組織病理學(xué)改變主要包括腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，腎小管上皮細(xì)胞變性、再生，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，弼鹽沉著、腎盂擴(kuò)張以及蛋白管型。除第2天60 mg/kg組3/6動物、120 mg/kg組1/6動物出現(xiàn)極輕度腎小管上皮細(xì)胞的變性、壞死外，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死表現(xiàn)出較明顯的時(shí)間和劑量相關(guān)性。隨給藥劑量及給藥時(shí)間的增加，慶大霉素給藥組動物出現(xiàn)該病變的動物數(shù)增加，病變程度也隨之加重。腎小管上皮細(xì)胞變性、再生在第2天和第4天的對照組及慶大霉素給藥組中均有部分動物出現(xiàn)，但120 mg/kg組病變動物數(shù)略高于對照組。間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤在對照組也偶有動物出現(xiàn)，但第8天和第11天慶大霉素給藥組間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤的動物數(shù)明顯增加，且都同時(shí)伴有腎小管上皮細(xì)胞的變性、壞死（表1-1-4)。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2725506