【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患全球性傳染疾病，人和動(dòng)物一旦發(fā)病，幾乎100%死亡。WHO推薦，對(duì)于狂犬病暴露，尤其嚴(yán)重暴露者應(yīng)全程注射狂犬疫苗與抗狂犬病抗體。抗血清對(duì)預(yù)防狂犬病起著至關(guān)重要作用,由于馬免疫血清（ERIG）副反應(yīng)較大,而人源狂犬病免疫球蛋白（HRIG）來(lái)源有限，且存在潛在的病原污染與批次間差異等缺點(diǎn)。因此，急需開發(fā)治療用人源抗狂犬病單克隆抗體或者人源化基因工程抗體。同時(shí)無(wú)論是狂犬疫苗生產(chǎn)過程中的滴度檢測(cè)，還是疫苗免疫后的抗狂犬病中和抗體檢測(cè)都需要相應(yīng)的檢測(cè)抗體。 經(jīng)研究證明，由幾株能夠中和狂犬病毒的人源化單克隆抗體組成的雞尾酒混合抗體，有可能取代HRIG或ERIG用于狂犬病的暴露后預(yù)防。完整單克隆抗體必須在真核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)量小，成本高，而基因工程單鏈抗體可以在原核系統(tǒng)中高效表達(dá)。大腸桿菌是目前基因工程藥物廣泛使用的原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物常以包涵體的形式存在。因此，這種表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)性與純化工藝將成為基因工程下游技術(shù)的關(guān)鍵和難點(diǎn)。本論文主要研究了大規(guī)模制備抗狂犬病單鏈抗體scFV98H的發(fā)酵、復(fù)性和純化工藝，并探索作為診斷制劑和治療制劑的可行性。 本文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1．檢測(cè)方法的建立與驗(yàn)證 針對(duì)蛋白濃度測(cè)定方法（BCA法）進(jìn)行了驗(yàn)證，在8M尿素、3M尿素、0.1M尿素、10%甘油、5%蔗糖體系中對(duì)線性、準(zhǔn)確性、精密度、檢測(cè)下限和定量下限進(jìn)行了測(cè)定，在10%甘油、5%蔗糖體系檢測(cè)的線性范圍變窄，但是在各自的線性范圍內(nèi)，準(zhǔn)確性與精密度的CV20%，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。 針對(duì)測(cè)定大腸桿菌宿主DNA的方法（PicoGreen法）進(jìn)行了驗(yàn)證，在8M尿素體系、3M尿素體系、0.1M尿素體系中對(duì)線性、準(zhǔn)確性、精密度、檢測(cè)下限和定量下限等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定；3M尿素體系、0.1M尿素體系中準(zhǔn)確性與精密度的CV20%，線性關(guān)系良好，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，8M尿素體系的樣品需要稀釋到3M以下進(jìn)行檢測(cè)。 建立了狂犬病中和抗體的檢測(cè)方法——RFFIT法；對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證，測(cè)定了RFFIT法的特異性、線性、準(zhǔn)確性、精密度、檢測(cè)下限和定量下限等指標(biāo)；在3M尿素體系、0.1M尿素體系、10%甘油體系、5%蔗糖體系中檢測(cè)結(jié)果的CV30%，證明該方法穩(wěn)定可靠，可以作為復(fù)性工藝開發(fā)中單鏈抗體活性分析方法。 2．發(fā)酵與包涵體洗滌工藝初步研究 本研究鑒定了攜帶scFv98H基因的工程菌種，進(jìn)行了大比例傳代，連續(xù)傳10代之后，質(zhì)粒拷貝數(shù)穩(wěn)定，目的蛋白正確表達(dá)，蛋白表達(dá)量與原始菌種一致。在搖瓶培養(yǎng)水平，篩選出scFv98H基因的工程菌種的適宜培養(yǎng)基為：完全自誘導(dǎo)培養(yǎng)基或IPTG代替乳糖的不完全自誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在3L生物反應(yīng)器水平，篩選出scFv98H基因的工程菌種適宜的發(fā)酵pH范圍為：7.0-7.5；適宜的發(fā)酵pH調(diào)節(jié)方式為：25%濃氨水作為pH調(diào)節(jié)劑。用不含乳糖的不完全自誘導(dǎo)培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以相同的補(bǔ)料方式，采用3L發(fā)酵罐與14L發(fā)酵罐發(fā)酵得到的單位體積的菌體濕生相同。菌體超聲后分離包涵體的離心轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間為8000rpm、10min，離心兩遍；溶液Ⅰ的攪拌洗滌時(shí)間為120min；溶液Ⅲ的洗滌后的離心條件為10000rpm、10min。 3．單鏈抗體scFV98H的純化復(fù)性工藝研究 scFv98H包涵體蛋白在變性條件下，采用IMAC親和層析、SP、QXL離子交換層析以吸附洗脫模式，能將目的蛋白與大部分雜質(zhì)分開，純化效果和穩(wěn)定性較好。采用DEAE、QXL、Nuvia Q以流穿模式，都能將scFv98H包涵體蛋白與大部分雜質(zhì)分開，樣品處理效率高。采用Nuvia Q的目的蛋白回收率最高，重復(fù)性較好。用透析復(fù)性的方式篩選出最適pH值，結(jié)合實(shí)際情況確定為pH9.0。作為診斷制劑的scFv98H蛋白，精細(xì)純化工藝路線為：IMAC親和層析，QXL吸附洗脫，透析復(fù)性。作為治療制劑的scFv98H蛋白，精細(xì)純化工藝路線為：Nuvia Q流穿純化，脫鹽后，QXL柱上復(fù)性。 4．單鏈抗體scFV98H的診斷應(yīng)用研究 運(yùn)用診斷制劑純化復(fù)性工藝，制備了scFv98H抗體蛋白，并對(duì)復(fù)性后單體，二聚體進(jìn)行了分離，分子量鑒定結(jié)果為：scFv98H抗體蛋白單體的分子量30Kda左右，scFv98H抗體蛋白二聚體的分子量60Kda左右。對(duì)單鏈抗體scFv98H的特異性進(jìn)行了鑒定，能與滅活狂犬病毒特異結(jié)合。對(duì)單鏈抗體scFv98H與市售的抗狂犬病毒核蛋白單克隆抗體（NP mAb）的結(jié)合能力在ELISA和細(xì)胞免疫熒光應(yīng)用進(jìn)行了比較，在相同蛋白濃度下，二者結(jié)合能力相當(dāng)。測(cè)定了scFv98H抗體的親和力常數(shù)Kd為1×106M1。應(yīng)用scFv98H抗體與NP mAb，對(duì)高中低三個(gè)水平的ERIG和HRIG的中和抗體效價(jià)，和高低水平的MRIG和RRIG中和抗體進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，scFv98H抗體與NP mAb的檢測(cè)值經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析沒有顯著性差異。應(yīng)用scFv98H抗體與NP mAb，針對(duì)不同狂犬病毒株的病毒增殖曲線進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，scFv98H抗體與NP mAb的檢測(cè)值經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析沒有顯著性差異。 5．單鏈抗體scFV98H的治療應(yīng)用研究 運(yùn)用治療制劑純化復(fù)性工藝，制備了scFv98H抗體蛋白，假病毒體系鑒定了scFv98H抗體的中和活性，與HRIG一樣能特異地中和假病毒。運(yùn)用RFFIT法檢測(cè)scFv98H抗體的中和效價(jià)，大于1000IU/mg。檢測(cè)到scFv98H抗體能與感染狂犬病毒的活細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)合，而MAbNP不能結(jié)合。建立了狂犬病毒暴露后動(dòng)物模型，用HRIG驗(yàn)證了該模型，為檢測(cè)scFv98H抗體在動(dòng)物水平的保護(hù)效果奠定了基礎(chǔ)。運(yùn)用建立的狂犬病毒暴露后動(dòng)物模型，檢測(cè)scFv98H在狂犬病毒暴露后2小時(shí)，20IU/kg的劑量，保護(hù)率可達(dá)70%，與陽(yáng)性對(duì)照HRIG80%的保護(hù)率沒有顯著性差異。 構(gòu)建了scFv98N的表達(dá)菌株，根據(jù)scFv98H抗體蛋白制備的工藝路線，制備了scFv98N抗體。對(duì)scFv98N抗體的結(jié)合活性與中和活性進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)合活性和中和活性與scFv98H比較沒有顯著性差異。ScFv98N蛋白37°C放置加速穩(wěn)定性結(jié)果表明，與ERIG的熱穩(wěn)定性一致；藥代動(dòng)力結(jié)果表明，體內(nèi)代謝穩(wěn)定性低于ERIG。運(yùn)用建立的狂犬病毒暴露后動(dòng)物模型檢測(cè)scFv98N在狂犬病毒暴露后2小時(shí)，20IU/kg的劑量，保護(hù)率可達(dá)70%，與陽(yáng)性對(duì)照HRIG80%的保護(hù)率沒有顯著性差異。 總之，以上研究結(jié)果表明，本研究建立了單鏈抗體的制備工藝，采用該工藝生產(chǎn)的scFv98H具有診斷和治療狂犬病毒感染的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392.11

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李偉,歐陽(yáng)藩;重組鏈激酶三種復(fù)性方式的比較[J];藥物生物技術(shù);1999年04期

本文編號(hào)：2722428