發(fā)布時間：2020-06-20 12:38

【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患全球性傳染疾病，人和動物一旦發(fā)病，幾乎100%死亡。WHO推薦，對于狂犬病暴露，尤其嚴重暴露者應全程注射狂犬疫苗與抗狂犬病抗體�？寡鍖︻A防狂犬病起著至關重要作用,由于馬免疫血清（ERIG）副反應較大,而人源狂犬病免疫球蛋白（HRIG）來源有限，且存在潛在的病原污染與批次間差異等缺點。因此，急需開發(fā)治療用人源抗狂犬病單克隆抗體或者人源化基因工程抗體。同時無論是狂犬疫苗生產過程中的滴度檢測，還是疫苗免疫后的抗狂犬病中和抗體檢測都需要相應的檢測抗體。 經研究證明，由幾株能夠中和狂犬病毒的人源化單克隆抗體組成的雞尾酒混合抗體，有可能取代HRIG或ERIG用于狂犬病的暴露后預防。完整單克隆抗體必須在真核系統(tǒng)中進行表達，表達量小，成本高，而基因工程單鏈抗體可以在原核系統(tǒng)中高效表達。大腸桿菌是目前基因工程藥物廣泛使用的原核表達系統(tǒng)，表達產物常以包涵體的形式存在。因此，這種表達產物的復性與純化工藝將成為基因工程下游技術的關鍵和難點。本論文主要研究了大規(guī)模制備抗狂犬病單鏈抗體scFV98H的發(fā)酵、復性和純化工藝，并探索作為診斷制劑和治療制劑的可行性。 本文主要研究內容和結果如下： 1．檢測方法的建立與驗證 針對蛋白濃度測定方法（BCA法）進行了驗證，在8M尿素、3M尿素、0.1M尿素、10%甘油、5%蔗糖體系中對線性、準確性、精密度、檢測下限和定量下限進行了測定，在10%甘油、5%蔗糖體系檢測的線性范圍變窄，但是在各自的線性范圍內，準確性與精密度的CV20%，符合可接受標準。 針對測定大腸桿菌宿主DNA的方法（PicoGreen法）進行了驗證，在8M尿素體系、3M尿素體系、0.1M尿素體系中對線性、準確性、精密度、檢測下限和定量下限等指標進行了測定；3M尿素體系、0.1M尿素體系中準確性與精密度的CV20%，線性關系良好，符合可接受標準，8M尿素體系的樣品需要稀釋到3M以下進行檢測。 建立了狂犬病中和抗體的檢測方法——RFFIT法；對該方法進行了驗證，測定了RFFIT法的特異性、線性、準確性、精密度、檢測下限和定量下限等指標；在3M尿素體系、0.1M尿素體系、10%甘油體系、5%蔗糖體系中檢測結果的CV30%，證明該方法穩(wěn)定可靠，可以作為復性工藝開發(fā)中單鏈抗體活性分析方法。 2．發(fā)酵與包涵體洗滌工藝初步研究 本研究鑒定了攜帶scFv98H基因的工程菌種，進行了大比例傳代，連續(xù)傳10代之后，質�？截悢�(shù)穩(wěn)定，目的蛋白正確表達，蛋白表達量與原始菌種一致。在搖瓶培養(yǎng)水平，篩選出scFv98H基因的工程菌種的適宜培養(yǎng)基為：完全自誘導培養(yǎng)基或IPTG代替乳糖的不完全自誘導培養(yǎng)基。在3L生物反應器水平，篩選出scFv98H基因的工程菌種適宜的發(fā)酵pH范圍為：7.0-7.5；適宜的發(fā)酵pH調節(jié)方式為：25%濃氨水作為pH調節(jié)劑。用不含乳糖的不完全自誘導培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，以相同的補料方式，采用3L發(fā)酵罐與14L發(fā)酵罐發(fā)酵得到的單位體積的菌體濕生相同。菌體超聲后分離包涵體的離心轉數(shù)和時間為8000rpm、10min，離心兩遍；溶液Ⅰ的攪拌洗滌時間為120min；溶液Ⅲ的洗滌后的離心條件為10000rpm、10min。 3．單鏈抗體scFV98H的純化復性工藝研究 scFv98H包涵體蛋白在變性條件下，采用IMAC親和層析、SP、QXL離子交換層析以吸附洗脫模式，能將目的蛋白與大部分雜質分開，純化效果和穩(wěn)定性較好。采用DEAE、QXL、Nuvia Q以流穿模式，都能將scFv98H包涵體蛋白與大部分雜質分開，樣品處理效率高。采用Nuvia Q的目的蛋白回收率最高，重復性較好。用透析復性的方式篩選出最適pH值，結合實際情況確定為pH9.0。作為診斷制劑的scFv98H蛋白，精細純化工藝路線為：IMAC親和層析，QXL吸附洗脫，透析復性。作為治療制劑的scFv98H蛋白，精細純化工藝路線為：Nuvia Q流穿純化，脫鹽后，QXL柱上復性。 4．單鏈抗體scFV98H的診斷應用研究 運用診斷制劑純化復性工藝，制備了scFv98H抗體蛋白，并對復性后單體，二聚體進行了分離，分子量鑒定結果為：scFv98H抗體蛋白單體的分子量30Kda左右，scFv98H抗體蛋白二聚體的分子量60Kda左右。對單鏈抗體scFv98H的特異性進行了鑒定，能與滅活狂犬病毒特異結合。對單鏈抗體scFv98H與市售的抗狂犬病毒核蛋白單克隆抗體（NP mAb）的結合能力在ELISA和細胞免疫熒光應用進行了比較，在相同蛋白濃度下，二者結合能力相當。測定了scFv98H抗體的親和力常數(shù)Kd為1×106M1。應用scFv98H抗體與NP mAb，對高中低三個水平的ERIG和HRIG的中和抗體效價，和高低水平的MRIG和RRIG中和抗體進行了測定，結果表明，scFv98H抗體與NP mAb的檢測值經統(tǒng)計分析沒有顯著性差異。應用scFv98H抗體與NP mAb，針對不同狂犬病毒株的病毒增殖曲線進行檢測，結果表明，scFv98H抗體與NP mAb的檢測值經統(tǒng)計分析沒有顯著性差異。 5．單鏈抗體scFV98H的治療應用研究 運用治療制劑純化復性工藝，制備了scFv98H抗體蛋白，假病毒體系鑒定了scFv98H抗體的中和活性，與HRIG一樣能特異地中和假病毒。運用RFFIT法檢測scFv98H抗體的中和效價，大于1000IU/mg。檢測到scFv98H抗體能與感染狂犬病毒的活細胞表面的糖蛋白結合，而MAbNP不能結合。建立了狂犬病毒暴露后動物模型，用HRIG驗證了該模型，為檢測scFv98H抗體在動物水平的保護效果奠定了基礎。運用建立的狂犬病毒暴露后動物模型，檢測scFv98H在狂犬病毒暴露后2小時，20IU/kg的劑量，保護率可達70%，與陽性對照HRIG80%的保護率沒有顯著性差異。 構建了scFv98N的表達菌株，根據(jù)scFv98H抗體蛋白制備的工藝路線，制備了scFv98N抗體。對scFv98N抗體的結合活性與中和活性進行測定，其結合活性和中和活性與scFv98H比較沒有顯著性差異。ScFv98N蛋白37°C放置加速穩(wěn)定性結果表明，與ERIG的熱穩(wěn)定性一致；藥代動力結果表明，體內代謝穩(wěn)定性低于ERIG。運用建立的狂犬病毒暴露后動物模型檢測scFv98N在狂犬病毒暴露后2小時，20IU/kg的劑量，保護率可達70%，與陽性對照HRIG80%的保護率沒有顯著性差異。 總之，以上研究結果表明，本研究建立了單鏈抗體的制備工藝，采用該工藝生產的scFv98H具有診斷和治療狂犬病毒感染的應用前景。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392.11

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 李偉,歐陽藩;重組鏈激酶三種復性方式的比較[J];藥物生物技術;1999年04期

本文編號：2722428