【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),簡稱金葡菌(S.aureus),是革蘭氏陽性球菌家族的一員,其能夠引發(fā)皮膚感染、肺炎、心內(nèi)膜炎和菌血癥等多種感染性疾病。已有研究表明生物膜參與了金葡菌在體內(nèi)的存活以及致病過程。人體內(nèi)的各種植入物均能成為金葡菌形成生物膜的場所,包括神經(jīng)外科植入物、心臟支架、中央靜脈導(dǎo)管甚至隱形眼鏡都能檢測到金葡菌形成的生物膜。生物膜通過其自身特殊結(jié)構(gòu)在細(xì)菌定植以及感染階段均為細(xì)菌提供了充分的保護(hù),其可以降低宿主抗菌肽的殺細(xì)菌作用、抑制吞噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬殺傷作用,更為關(guān)鍵的是生物膜對(duì)抗生素的抵抗力較強(qiáng),使抗生素不能有效作用于細(xì)菌進(jìn)而失去抗菌作用。除此之外,生物膜在發(fā)育到成熟階段后會(huì)發(fā)生解離,生物膜中的細(xì)菌能通過人體循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散至新的感染部位從而引起全身性感染。生物膜(biofilm)是粘附在基質(zhì)表面的微生物群體構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu),其內(nèi)部的微生物可產(chǎn)生高度水合的胞外聚合物基質(zhì)(extracellular polymeric substances,EPS)來包裹自身。EPS的主要成分有中胞外蛋白質(zhì)、胞外DNA和胞外多糖等成分,其中胞外DNA是構(gòu)成致病菌生物膜的主要結(jié)構(gòu)組分。其胞外蛋白主要有DNABII家族蛋白,包括類組蛋白HU和集合宿主因子蛋白IHF,上述蛋白與DNA具有較高親和力,且與DNA結(jié)合為二聚體形式。DNA結(jié)合蛋白家族(DNABII)通過與DNA結(jié)合,構(gòu)成生物膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),這在生物膜形成過程中具有重要作用。體內(nèi)外的研究結(jié)果表明,靶向DNABII家族蛋白的抗血清可以破壞生物膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致已形成的生物膜分解,釋放包裹在生物膜內(nèi)的細(xì)菌,在此基礎(chǔ)上聯(lián)合使用抗菌藥從而達(dá)到治療目的。噬菌體抗體庫技術(shù)是指將編碼噬菌體P3和P8外殼蛋白的III或VIII基因與抗體的重鏈和輕鏈進(jìn)行基因重組,然后感染大腸桿菌并在大腸桿菌中增殖,最終在噬菌體表面,外殼蛋白與抗體ScFv或Fab片段以融合蛋白的形式展示在細(xì)菌表面。噬菌體顆粒能通過感染宿主菌進(jìn)行擴(kuò)增并且特異性識(shí)別抗原,經(jīng)“吸附一洗脫一擴(kuò)增”的循環(huán)可大量富集,最終可篩選出針對(duì)抗原的特異性抗體。噬菌體抗體庫將表型與基因型直接聯(lián)系起來,從而可將特異性抗體從眾多單克隆中高效率地篩選出來。金葡菌HU蛋白是DNABII家族蛋白成員之一,其是以非依賴序列的方式結(jié)合胞外DNA,但是HU與金葡菌生物膜形成的相關(guān)研究報(bào)道較少。因此,本研究通過基因重組表達(dá)純化HU蛋白并制備其特異性抗體等方法,探討靶向HU蛋白的單克隆和多克隆抗體對(duì)金葡菌生物膜形成的影響。研究目的通過基因重組表達(dá)純化HU蛋白并制備其特異性抗體等方法,探討靶向HU蛋白的單克隆和多克隆抗體對(duì)金葡菌生物膜形成的影響。研究方法1)金葡菌HU蛋白的表達(dá)情況。通過構(gòu)建重組表達(dá)載體,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)HU蛋白,并通過Ni2+螯合樹脂親和純化檢測HU蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。2)HU特異性抗體的制備和功能初步研究。利用重組HU蛋白免疫大耳白兔制備其多克隆抗體。同時(shí)利用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選抗HU蛋白的全人源單克隆抗體,進(jìn)一步利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系重組表達(dá)和純化抗體。通過ELISA和Western blot方法檢測蛋白HU與其特異性抗體的結(jié)合能力。3)HU特異性抗體對(duì)金葡菌體外生物膜形成的影響。通過體外生物膜形成實(shí)驗(yàn),利用結(jié)晶紫染色和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)的方法檢測HU特異性抗體是否能抑制金葡菌生物膜的形成。并進(jìn)一步用PIA斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)檢測了抗體處理后生物膜重要組分PIA的表達(dá)水平。4)HU特異性抗體對(duì)金葡菌體內(nèi)生物膜形成的影響。通過構(gòu)建了導(dǎo)管植入動(dòng)物模型,利用激光共聚焦顯微鏡觀察金葡菌在植入體內(nèi)的導(dǎo)管中形成的生物膜。并進(jìn)一步檢測加入HU特異性抗體是否能夠抑制小鼠體內(nèi)植入導(dǎo)管中金葡菌生物膜的形成。研究結(jié)果1)成功構(gòu)建了pET-28a-HU高效表達(dá)載體,并且純化獲得了純度較高的金葡菌重組蛋白HU。2)利用重組HU蛋白免疫大耳白兔制備了抗HU多克隆抗體(anti-HU)。同時(shí),利用噬菌體抗體庫技術(shù),經(jīng)過三輪淘洗篩選獲得一個(gè)全人源單克隆抗體YG6,利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系重組表達(dá)了YG6。ELISA和Western免疫印跡結(jié)果表明anti-HU和YG6都能夠特異性結(jié)合HU。3)Anti-HU以及YG6能夠明顯抑制體外金葡菌生物膜的形成,且具有一定的濃度依賴性。同時(shí)anti-HU以及YG6能抑制PIA的表達(dá)。4)建立了生物膜形成動(dòng)物模型。含綠色熒光GFP質(zhì)粒的8325菌株成功在小鼠體內(nèi)植入的導(dǎo)管中形成了生物膜,并可通過激光共聚焦顯微鏡下觀察形成的生物膜形態(tài)。同時(shí)anti-HU以及YG6抗體都能夠抑制小鼠體內(nèi)植入導(dǎo)管中金葡菌生物膜的形成。結(jié)論重組表達(dá)了金葡菌HU蛋白,并制備了其相應(yīng)的多克隆抗體和篩選了其特異性全人源抗體,體內(nèi)外的研究結(jié)果表明抗HU抗體能夠抑制金葡菌生物膜的形成。研究結(jié)果提示HU蛋白參與了金葡菌生物膜的形成,靶向HU蛋白有可能會(huì)阻斷金葡菌體內(nèi)定植和感染。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R378
【圖文】：

黃色葡萄球菌 DNA 結(jié)合蛋白 HU 生物學(xué)功能的初步探究2圖1 金葡菌生物膜發(fā)育過程模型[4]圖注：金葡菌生物膜的發(fā)育分為五個(gè)階段：（A）附著，(B)增殖，(C)外流，(D)成熟，（E）分散。A.金葡菌細(xì)胞分別通過疏水性相互作用或 MSCRAMM 與非生物或生物表面連接。B.細(xì)胞附著后，生物膜發(fā)育成由eDNA和蛋白質(zhì)基質(zhì)組成的細(xì)胞的融合“墊”。C.達(dá)到匯合時(shí)，發(fā)生一段時(shí)間的細(xì)胞大量出現(xiàn)，其中細(xì)胞亞群通過 Sae 調(diào)節(jié)的核酸酶介導(dǎo)的 eDNA 降解從生物膜釋放以允許形成三維微菌落。D.小型菌落形成于在外流階段保持附著的不同細(xì)胞灶。這個(gè)階段的特征是快速的細(xì)胞分裂，形成由包括 PSM 和 eDNA在內(nèi)的蛋白質(zhì)組成的穩(wěn)健聚集體。E.活化的 Agr 介導(dǎo)的群體感應(yīng)通過蛋白酶活化和/或PSM 產(chǎn)生啟動(dòng)生物膜基質(zhì)調(diào)節(jié)和細(xì)胞分散。AtlA 表示 autolysin A; MSCRAMM 表示microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules; eDNA 表 示extracellular DNA;PSM 表示 phenol soluble modulins; Agr 表示 accessory gene regulator.在初始粘附階段

而且它能促使細(xì)胞在成熟后從生物膜上解離下來，這對(duì)體內(nèi)生物膜具有重要的影響。萄球菌生物膜中，最重要的粘附因子是胞外多糖 細(xì)胞間粘charide intercellular adhesin，PIA 或 PNAG）[8]。如圖 2 所示，PIA，β-1葡糖胺（GlcNAc）殘基的均聚物位于金葡菌細(xì)胞表面上的纖維鏈中，與金葡菌生物膜的形成。 PIA 由 ica 基因位點(diǎn)編碼，由 icaA、icaB、組成。 IcaA 和 IcaD 形成于細(xì)胞膜中的乙酰葡萄糖胺糖基轉(zhuǎn)lcNActransferase）。另一個(gè)推定的膜蛋白 IcaC 是形成生物膜所需的較能參與不斷增長的 PIA 鏈的出口。膜表面蛋白 icaB 將分泌到胞外的化。PIA 合成大致分為三步：首先，IcaA 將來自 UDP-GlcNAc 的 G正在延伸的 PIA 鏈上，IcaA 的活性與 IcaD 密切相關(guān)；接著 IcaC 鏈轉(zhuǎn)運(yùn)出去；PIA 轉(zhuǎn)運(yùn)出去后在表面錨定蛋白 IcaB 的作用下發(fā)生去正電的殘基，PIA 的帶電情況與其在細(xì)胞表面附著以及生物活性密切

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