【摘要】：登革病毒(Dengue Virus, DENV)是一種流行于熱帶與亞熱帶的RNA負鏈病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬。通過蚊子的叮咬，四個亞型的登革病毒交替?zhèn)鞑�。人類在感染登革病毒后會引起登革�?Classic Dengue Fever, DF)，當?shù)诙卧馐懿煌瑏喰透腥疽院�，先前存在的非中和抗體不但起不到免疫保護作用，反而攜帶入侵機體的病毒感染靶細胞，使機體發(fā)生嚴重的登革出血熱(Dengue Hemorrhagic Fever,DHF)或終身不愈的登革休克綜合癥(Dengue Shock Syndrome, DSS)，甚至死亡，這種現(xiàn)象被稱為抗體依賴增強(Antibody dependent enhancement,ADE)。至今，全世界有許多種登革病毒疫苗被加以研究，但由于ADE現(xiàn)象的存在導致目前沒有任何登革疫苗被批準上市。鑒于ADE現(xiàn)象導致嚴重疾病的機理還無法徹底闡明，以及登革病毒感染后的交叉保護機制也并不清楚，所以理想的登革病毒疫苗應能激發(fā)機體對四種亞型登革病毒都產(chǎn)生免疫保護力。在能抵抗四種登革病毒感染的同時，登革病毒疫苗還應具有可以激發(fā)長效、安全的免疫應答與免疫保護的能力。目前對登革病毒疫苗開發(fā)的重心集中在如何提高疫苗所激發(fā)的中和抗體水平，以及降低ADE現(xiàn)象的問題上。登革病毒的表面蛋白E蛋白(Envelope portein)攜帶有主要中和抗體表位，而且E蛋白所激發(fā)抗體的ADE活性要低于免疫完整病毒所激發(fā)抗體的ADE活性。但是由于亞單位疫苗本身特性所決定，基于E蛋白開發(fā)的亞單位疫苗的效果并不理想。本文的目的是開發(fā)一種新型登革病毒疫苗，在具備完全病毒疫苗可以激發(fā)良好免疫應答能力的前提下降低引發(fā)ADE現(xiàn)象的風險，而且研究結(jié)果應該既要有作為疫苗應用的潛力，又可為更深一步的研究奠定基礎�；谝陨项A期設想，本文采取了以病毒空殼來作為疫苗應用實驗思路。通過物理方法去掉登革病毒的病毒核心顆粒后，將攜帶病毒表面蛋白的登革病毒包膜重建為與天然病毒空間結(jié)構(gòu)一致的病毒空殼。通過細胞水平實驗與動物水平實驗，鑒定登革病毒空殼的免疫原性以及所激發(fā)抗體的ADE的活性，為登革病毒疫苗的開發(fā)提供新的方向，也為研制4價登革病毒疫苗打下基礎。 本文主要工作可分為研制登革病毒空殼疫苗與解決病毒空殼制備過程中關鍵技術(shù)兩個部分。工作主要內(nèi)容涉及了登革病毒空殼免疫原性研究，以及制備病毒空殼過程中的三個關鍵問題，共四部分內(nèi)容： 1. DENV-2病毒空殼免疫原性研究。利用DENV-2制備了DENV-2病毒空殼，并對病毒空殼進行理化性質(zhì)鑒定，以及生物活性鑒定。利用DENV-2病毒空殼免疫小鼠，對病毒空殼所激發(fā)的細胞免疫以及體液免疫進行評價。對登革病毒空殼激發(fā)免疫應答能力的評價結(jié)束后，本文在細胞水平上對DENV-2病毒空殼免疫后血清做了中和抗體活性的評價，同時也對免疫后血清的ADE的活性做了評價。由于登革病毒沒有致病生物模型，本文通過2日齡乳鼠顱內(nèi)接種的方法對免疫后血清做了免疫保護能力評價。 2.建立規(guī)�；歉锊《局苽渑c純化方法。由于制備病毒空殼需要較大數(shù)量的高純度的病毒作為原材料，本文馴化并篩選了低血清培養(yǎng)的單克隆Vero細胞系，在優(yōu)化了病毒培養(yǎng)條件的同時，摸索了雙水相萃取法純化登革病毒的條件，在不利用超速離心方法的前提下，可一次性制備大量高純度病毒。 3.建立規(guī)�；歉锊《究諝ぶ苽浞椒�。篩選了用于制備病毒空殼的常見去污劑，并對病毒空殼制備的條件進行了優(yōu)化，解決了目前制備病毒空殼所用去污劑過于昂貴，以及無法大量制備病毒空殼的問題。 4.解決了病毒空殼無法進行生產(chǎn)的問題。建立了登革病毒空殼制備的操作工藝，并且進行了中試生產(chǎn)，解決了病毒空殼難以生產(chǎn)為產(chǎn)品的問題，使登革病毒空殼疫苗規(guī)�；a(chǎn)成為可能。 在DENV-2病毒空殼免疫原性研究工作部分中，取得的結(jié)果主要包括DENV-2病毒空殼激發(fā)體液免疫能力、激發(fā)細胞免疫能力、所激發(fā)抗體的病毒中和活性與ADE活性等內(nèi)容，結(jié)果顯示DENV-2病毒空殼在保留了天然DENV-2病毒免疫原性的同時，降低了引發(fā)ADE現(xiàn)象的可能。在解決病毒空殼制備過程中存在的關鍵問題的工作部分中，本文建立了可規(guī)�；苽洳⒓兓疍ENV-2的方法、可規(guī)�；苽銬ENV-2病毒空殼的方法，同時設計了一套DENV-2病毒空殼的中試生產(chǎn)工藝，并成功進行了中試�，F(xiàn)將本文所取得的主要結(jié)果介紹如下： 1. DENV-2病毒空殼激發(fā)免疫應答能力。本文首次將病毒空殼技術(shù)應用在登革病毒上，成功的制備了登革病毒空殼。同時對DENV-2病毒空殼進行了激發(fā)免疫應答能力的研究、抗體中和活性及ADE活性的研究、以及產(chǎn)生免疫保護能力研究等免疫原性研究。結(jié)果顯示，本文所制備的登革病毒空殼在外觀上呈現(xiàn)與天然病毒一致的顆粒狀，只攜帶了登革病毒的表面蛋白E蛋白。同時所制備的DENV-2病毒空殼在體外可與天然DENV-2病毒競爭宿主細胞表面的受體，其受體封閉效率BA50達101.7(LogBA50=1.7)。說明病毒空殼在入侵宿主細胞能力上與天然病毒功能一致。在免疫應答研究結(jié)果中顯示，DENV-2病毒空殼可激發(fā)與天然病毒一致的抗體應答，在只含有E蛋白的前提下，DENV-2病毒空殼所激發(fā)的IgG抗體滴度(Log10)可達3.56，與天然病毒平均激發(fā)的3.62相似。對所激發(fā)IgG中IgG1與IgG2a亞型研究結(jié)果顯示，DENV-2病毒空殼所激發(fā)的IgG抗體中IgG1濃度與免疫天然病毒所激發(fā)抗體相似，但是IgG2a濃度卻比天然病毒所誘導的略高，說明DENV-2病毒空殼更傾向于誘導IgG2a。病毒空殼更傾向于激發(fā)IgG2a的產(chǎn)生，預示著免疫DENV-2病毒空殼有可能比免疫完全病毒更有利于后期體內(nèi)病毒的清除，對感染后病毒血癥的消除也將會更加有利。在細胞免疫應答研究中，天然登革病毒可激發(fā)較高水平IFN-γ及IL-4陽性T細胞產(chǎn)生，但IFN-γ陽性細胞要高于IL-4陽性細胞，這意味著免疫天然病毒或自然感染狀態(tài)下機體免疫反應會傾向Th1的應答，而Th1/Th2的應答不平衡也正是一些疫苗造成免疫損傷的原因。當免疫DENV-2病毒空殼后，IFN-γ及IL-4的陽性T細胞水平都較低，這一方面說明只含有E蛋白的病毒空殼比完全病毒刺激細胞免疫應答的能力較弱，但另一方面也顯現(xiàn)出免疫病毒空殼后所引發(fā)免疫損傷的機率較小的優(yōu)勢。 2. DENV-2病毒空殼所激發(fā)抗體的病毒中和能力與ADE活性。將DENV-2病毒空殼與天然病毒免疫Balb/C小鼠后，對免疫小鼠血清做了中和抗體活性以及ADE活性研究。結(jié)果顯示，DENV-2病毒空殼所激發(fā)的抗體與天然病毒所激發(fā)的抗體具備相似的中和能力，其中DENV-2病毒空殼誘導的抗體在中和50%DENV-2感染能力(50%Focus Reduction Neutralizing Test, FRNT50)時的滴度為102.314(LogFRNT50=2.314)，與天然DENV-2所激發(fā)抗體的中和能力相似(LogFRNT50=2.389)。在對DENV-1感染時的中和實驗結(jié)果顯示，DENV-2病毒空殼所激發(fā)抗體的中和能力(LogFRNT50=1.696)也與天然DENV-2一致(LogFRNT50=1.717)。對免疫后血清增強DENV-1感染能力的研究結(jié)果中顯示，病毒空殼所激發(fā)抗體在高濃度時的ADE活性較天然病毒所激發(fā)抗體略強，這推斷是由于在高濃度抗體情況下，天然病毒所激發(fā)的中和抗體與非中和抗體都對病毒感染產(chǎn)生了阻礙作用。當隨著抗體濃度的降低，免疫DENV-2天然病毒所激發(fā)抗體的ADE活性迅速增強，最高可使DENV-1增加56％的感染能力，而免疫DENV-2病毒空殼后，抗體的ADE活性此時沒有隨著抗體濃度的降低而迅速增加，最高使DENV-1感染能力增加46％。通過對免疫后抗體的中和活性以及ADE活性的結(jié)果分析顯示，免疫DENV-2病毒空殼后可激發(fā)與DENV-2天然病毒一致的中和抗體，但ADE活性卻較免疫天然病毒抗體有所降低。 3. DENV-2病毒空殼所激發(fā)抗體的免疫保護能力。由于缺乏致病動物模型，本文對免疫保護能力的研究采用了在體外將抗體與病毒孵育，再對乳鼠進行顱內(nèi)注射的方法對免疫保護能力進行評價。結(jié)果顯示，當將免疫DENV-2病毒空殼血清與DENV-2在體外孵育1h后再進行顱內(nèi)注射，大部分小鼠可以存活，并沒有發(fā)生神經(jīng)性病變。對乳鼠保護實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，免疫DENV-2病毒空殼后血清可抵抗5×104PFU和1×105PFU兩個滴度的DENV-2感染，1:40及1:80稀釋的免疫血清都可以對乳鼠產(chǎn)生免疫保護能力。在5×104PFU和1×105PFU的DENV-1感染實驗組中，1:80稀釋的DENV-2病毒空殼免疫血清對小鼠的保護力減弱，1:40稀釋的免疫血清組還具有免疫保護能力。結(jié)果說明DENV-2病毒空殼免疫后，對DENV-2的感染有較好的免疫保護能力，在抗體濃度較高的情況下，對DENV-1的感染也具有良好的免疫保護作用。 4.規(guī)模化登革病毒制備與純化方法建立。本文通過低血清馴化方法得到了在2％血清濃度下生長的單克隆Vero細胞系。通過鑒定及篩選制備了2％低血清濃度下生長的用于培養(yǎng)登革病毒的單克隆Vero細胞系。所建立的細胞系細胞復蘇效率達90.8％，培養(yǎng)時生長狀態(tài)穩(wěn)定，傳代周期為3d。在培養(yǎng)DENV-2病毒時，細胞生長豐度為80％，病毒接種量為0.05-0.1個MOI時可進行質(zhì)量穩(wěn)定的病毒大規(guī)模培養(yǎng)，病毒培養(yǎng)時間為72-96h，收毒后病毒滴度為4×105PFU/mL。本文利用硫酸銨與PEG1000建立雙水相體系，通過萃取方法可將DENV-2及PRRSV兩種不同病毒從含病毒細胞培養(yǎng)上清中萃取到富含PEG1000的上相。病毒原液經(jīng)過雙水相萃取純化并濃縮后，體積濃縮至原體積的20.9％。蛋白電泳檢測無雜蛋白，通過TCID50檢測病毒滴度達106.7TCID50/mL，PFU滴度達7×106PFU/mL。本文所建立的硫酸銨/PEG1000雙水相體系可成功應用于登革病毒的大規(guī)模濃縮與純化。 5.規(guī)�；歉锊《究諝ぶ苽浞椒ń�。用HNE緩沖液調(diào)整病毒蛋白濃度為2mg/mL后用終濃度0.3mg/mLTriton X-100對病毒顆粒進行裂解，通過Sepharose4FF分子篩層析分開溶解的病毒包膜與病毒核心，再經(jīng)超濾透析去除Triton X-100后病毒空殼可自動組裝。所制備的病毒空殼磷脂回收率為68.5％，蛋白回收率為58.6％，蛋白/磷脂比為1.84, Triton X-100殘留5.3%。經(jīng)鑒定，該大規(guī)模方法制備的DENV-2病毒空殼蛋白電泳檢測都無雜蛋白存在，透射電鏡檢測病毒空殼呈理論大小。同時，本文所建立的大規(guī)模病毒空殼制備方法可代替實驗室小規(guī)模制備方法，同時該方法可應用與其他病毒空殼生產(chǎn)。 6.登革病毒空殼制備的中試工藝設計。本文在解決了制備DENV-2病毒空殼所需大量高純度病毒、以及在大規(guī)模條件下制備病毒空殼的難點后，對DENV-2病毒空殼的制備工藝進行了設計與優(yōu)化，并以此工藝進行了中試生產(chǎn)。建立了一套生產(chǎn)技術(shù)路線，將DENV-2病毒空殼的制備過程量化為細胞培養(yǎng)、生產(chǎn)細胞培養(yǎng)、病毒半成品制備、病毒空殼半成品制備、疫苗成品制備5個過程。經(jīng)過對工藝進行量化及工序同期化的統(tǒng)籌后，細胞培養(yǎng)環(huán)節(jié)負責生產(chǎn)用Vero細胞的復蘇，每次提供3×107個細胞。生產(chǎn)細胞培養(yǎng)環(huán)節(jié)剛好用3×107個細胞接種一瓶15L轉(zhuǎn)瓶，并負責制備培養(yǎng)病毒用的單層細胞轉(zhuǎn)瓶。之后病毒半成品環(huán)節(jié)一次產(chǎn)出500mL蛋白濃度為2mg/mL的登革病毒，剛好用于一次病毒空殼制備。病毒空殼制備環(huán)節(jié)每次產(chǎn)出蛋白濃度為2mg/mL的病毒空殼100mL。所設計的生產(chǎn)技術(shù)路線每個環(huán)節(jié)都可獨立運轉(zhuǎn)，源源不斷的向下一環(huán)節(jié)提供需求。
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【圖文】：

革病毒疫苗研發(fā)面臨的困境，理想的登革病毒疫苗應能對四種亞型登革病毒都產(chǎn)生免疫保護能力。在能對抗四種登革病毒的同時，還應具有可以激發(fā)長效、平衡免疫保護的能力[9, 10, 13-16]。1.1 登革病毒空殼研究前景1.1.1 登革病毒背景登革病毒以白伊蚊為主要傳播媒介，流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)的 100 多個國家之中，是危害較大的一種蟲媒病毒[16]。DENV 病毒基因組長 11kb，含有一條單一開放讀碼框，共編碼 3 個結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM、E)和 7 個非結(jié)構(gòu)蛋白((NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、 NS5)。登革病毒顆粒呈球形，直徑約 45-55nm，病毒顆粒含脂蛋白包膜，并鑲嵌有糖蛋白 E 和 M。其中 E 基因編碼的 E 蛋白是病毒包膜的主要糖蛋白，分子量約為 51-60kD，含有多種 B 細胞和 T 細胞抗原表位并具有多種生物學功能，如結(jié)合靶細胞表面受體、介導膜融合、誘導產(chǎn)生中和抗體、紅細胞凝集等，是登革病毒的主要保護性抗原[17, 18]。

同時在 DENV 的致病和免疫過程中起著至關重要的作用。結(jié)構(gòu)域 ED III 為 IgG 免疫球蛋白樣折疊，具備誘導中和抗體表位及亞型特異性抗原表位，而沒有誘導產(chǎn)生非中和抗體與交叉反應抗體的抗原表位。所以以 ED III 作為抗原免疫機體，可以降低 ADE 現(xiàn)象的產(chǎn)生，但同時也缺少了交叉保護能力。因為 E 蛋白是病毒的主要表面蛋白，存在主要的中和位點，因此登革熱病毒 E 蛋白作為理想的抗原將很可能成為具備臨床應用價值的登革病毒疫苗，目前以各種載體表達獲得的 E 蛋白亞單位疫苗尚在研發(fā)中[21]。

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本文編號：2722093