【摘要】：登革病毒(Dengue Virus, DENV)是一種流行于熱帶與亞熱帶的RNA負(fù)鏈病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬。通過蚊子的叮咬，四個(gè)亞型的登革病毒交替?zhèn)鞑�。人類在感染登革病毒后�?huì)引起登革熱(Classic Dengue Fever, DF)，當(dāng)?shù)诙卧馐懿煌瑏喰透腥疽院螅惹按嬖诘姆侵泻涂贵w不但起不到免疫保護(hù)作用，反而攜帶入侵機(jī)體的病毒感染靶細(xì)胞，使機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的登革出血熱(Dengue Hemorrhagic Fever,DHF)或終身不愈的登革休克綜合癥(Dengue Shock Syndrome, DSS)，甚至死亡，這種現(xiàn)象被稱為抗體依賴增強(qiáng)(Antibody dependent enhancement,ADE)。至今，全世界有許多種登革病毒疫苗被加以研究，但由于ADE現(xiàn)象的存在導(dǎo)致目前沒有任何登革疫苗被批準(zhǔn)上市。鑒于ADE現(xiàn)象導(dǎo)致嚴(yán)重疾病的機(jī)理還無法徹底闡明，以及登革病毒感染后的交叉保護(hù)機(jī)制也并不清楚，所以理想的登革病毒疫苗應(yīng)能激發(fā)機(jī)體對(duì)四種亞型登革病毒都產(chǎn)生免疫保護(hù)力。在能抵抗四種登革病毒感染的同時(shí)，登革病毒疫苗還應(yīng)具有可以激發(fā)長(zhǎng)效、安全的免疫應(yīng)答與免疫保護(hù)的能力。目前對(duì)登革病毒疫苗開發(fā)的重心集中在如何提高疫苗所激發(fā)的中和抗體水平，以及降低ADE現(xiàn)象的問題上。登革病毒的表面蛋白E蛋白(Envelope portein)攜帶有主要中和抗體表位，而且E蛋白所激發(fā)抗體的ADE活性要低于免疫完整病毒所激發(fā)抗體的ADE活性。但是由于亞單位疫苗本身特性所決定，基于E蛋白開發(fā)的亞單位疫苗的效果并不理想。本文的目的是開發(fā)一種新型登革病毒疫苗，在具備完全病毒疫苗可以激發(fā)良好免疫應(yīng)答能力的前提下降低引發(fā)ADE現(xiàn)象的風(fēng)險(xiǎn)，而且研究結(jié)果應(yīng)該既要有作為疫苗應(yīng)用的潛力，又可為更深一步的研究奠定基礎(chǔ)�；谝陨项A(yù)期設(shè)想，本文采取了以病毒空殼來作為疫苗應(yīng)用實(shí)驗(yàn)思路。通過物理方法去掉登革病毒的病毒核心顆粒后，將攜帶病毒表面蛋白的登革病毒包膜重建為與天然病毒空間結(jié)構(gòu)一致的病毒空殼。通過細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)，鑒定登革病毒空殼的免疫原性以及所激發(fā)抗體的ADE的活性，為登革病毒疫苗的開發(fā)提供新的方向，也為研制4價(jià)登革病毒疫苗打下基礎(chǔ)。 本文主要工作可分為研制登革病毒空殼疫苗與解決病毒空殼制備過程中關(guān)鍵技術(shù)兩個(gè)部分。工作主要內(nèi)容涉及了登革病毒空殼免疫原性研究，以及制備病毒空殼過程中的三個(gè)關(guān)鍵問題，共四部分內(nèi)容： 1. DENV-2病毒空殼免疫原性研究。利用DENV-2制備了DENV-2病毒空殼，并對(duì)病毒空殼進(jìn)行理化性質(zhì)鑒定，以及生物活性鑒定。利用DENV-2病毒空殼免疫小鼠，對(duì)病毒空殼所激發(fā)的細(xì)胞免疫以及體液免疫進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)登革病毒空殼激發(fā)免疫應(yīng)答能力的評(píng)價(jià)結(jié)束后，本文在細(xì)胞水平上對(duì)DENV-2病毒空殼免疫后血清做了中和抗體活性的評(píng)價(jià)，同時(shí)也對(duì)免疫后血清的ADE的活性做了評(píng)價(jià)。由于登革病毒沒有致病生物模型，本文通過2日齡乳鼠顱內(nèi)接種的方法對(duì)免疫后血清做了免疫保護(hù)能力評(píng)價(jià)。 2.建立規(guī)�；歉锊《局苽渑c純化方法。由于制備病毒空殼需要較大數(shù)量的高純度的病毒作為原材料，本文馴化并篩選了低血清培養(yǎng)的單克隆Vero細(xì)胞系，在優(yōu)化了病毒培養(yǎng)條件的同時(shí)，摸索了雙水相萃取法純化登革病毒的條件，在不利用超速離心方法的前提下，可一次性制備大量高純度病毒。 3.建立規(guī)�；歉锊《究諝ぶ苽浞椒�。篩選了用于制備病毒空殼的常見去污劑，并對(duì)病毒空殼制備的條件進(jìn)行了優(yōu)化，解決了目前制備病毒空殼所用去污劑過于昂貴，以及無法大量制備病毒空殼的問題。 4.解決了病毒空殼無法進(jìn)行生產(chǎn)的問題。建立了登革病毒空殼制備的操作工藝，并且進(jìn)行了中試生產(chǎn)，解決了病毒空殼難以生產(chǎn)為產(chǎn)品的問題，使登革病毒空殼疫苗規(guī)�；a(chǎn)成為可能。 在DENV-2病毒空殼免疫原性研究工作部分中，取得的結(jié)果主要包括DENV-2病毒空殼激發(fā)體液免疫能力、激發(fā)細(xì)胞免疫能力、所激發(fā)抗體的病毒中和活性與ADE活性等內(nèi)容，結(jié)果顯示DENV-2病毒空殼在保留了天然DENV-2病毒免疫原性的同時(shí)，降低了引發(fā)ADE現(xiàn)象的可能。在解決病毒空殼制備過程中存在的關(guān)鍵問題的工作部分中，本文建立了可規(guī)�；苽洳⒓兓疍ENV-2的方法、可規(guī)�；苽銬ENV-2病毒空殼的方法，同時(shí)設(shè)計(jì)了一套DENV-2病毒空殼的中試生產(chǎn)工藝，并成功進(jìn)行了中試。現(xiàn)將本文所取得的主要結(jié)果介紹如下： 1. DENV-2病毒空殼激發(fā)免疫應(yīng)答能力。本文首次將病毒空殼技術(shù)應(yīng)用在登革病毒上，成功的制備了登革病毒空殼。同時(shí)對(duì)DENV-2病毒空殼進(jìn)行了激發(fā)免疫應(yīng)答能力的研究、抗體中和活性及ADE活性的研究、以及產(chǎn)生免疫保護(hù)能力研究等免疫原性研究。結(jié)果顯示，本文所制備的登革病毒空殼在外觀上呈現(xiàn)與天然病毒一致的顆粒狀，只攜帶了登革病毒的表面蛋白E蛋白。同時(shí)所制備的DENV-2病毒空殼在體外可與天然DENV-2病毒競(jìng)爭(zhēng)宿主細(xì)胞表面的受體，其受體封閉效率BA50達(dá)101.7(LogBA50=1.7)。說明病毒空殼在入侵宿主細(xì)胞能力上與天然病毒功能一致。在免疫應(yīng)答研究結(jié)果中顯示，DENV-2病毒空殼可激發(fā)與天然病毒一致的抗體應(yīng)答，在只含有E蛋白的前提下，DENV-2病毒空殼所激發(fā)的IgG抗體滴度(Log10)可達(dá)3.56，與天然病毒平均激發(fā)的3.62相似。對(duì)所激發(fā)IgG中IgG1與IgG2a亞型研究結(jié)果顯示，DENV-2病毒空殼所激發(fā)的IgG抗體中IgG1濃度與免疫天然病毒所激發(fā)抗體相似，但是IgG2a濃度卻比天然病毒所誘導(dǎo)的略高，說明DENV-2病毒空殼更傾向于誘導(dǎo)IgG2a。病毒空殼更傾向于激發(fā)IgG2a的產(chǎn)生，預(yù)示著免疫DENV-2病毒空殼有可能比免疫完全病毒更有利于后期體內(nèi)病毒的清除，對(duì)感染后病毒血癥的消除也將會(huì)更加有利。在細(xì)胞免疫應(yīng)答研究中，天然登革病毒可激發(fā)較高水平IFN-γ及IL-4陽(yáng)性T細(xì)胞產(chǎn)生，但I(xiàn)FN-γ陽(yáng)性細(xì)胞要高于IL-4陽(yáng)性細(xì)胞，這意味著免疫天然病毒或自然感染狀態(tài)下機(jī)體免疫反應(yīng)會(huì)傾向Th1的應(yīng)答，而Th1/Th2的應(yīng)答不平衡也正是一些疫苗造成免疫損傷的原因。當(dāng)免疫DENV-2病毒空殼后，IFN-γ及IL-4的陽(yáng)性T細(xì)胞水平都較低，這一方面說明只含有E蛋白的病毒空殼比完全病毒刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較弱，但另一方面也顯現(xiàn)出免疫病毒空殼后所引發(fā)免疫損傷的機(jī)率較小的優(yōu)勢(shì)。 2. DENV-2病毒空殼所激發(fā)抗體的病毒中和能力與ADE活性。將DENV-2病毒空殼與天然病毒免疫Balb/C小鼠后，對(duì)免疫小鼠血清做了中和抗體活性以及ADE活性研究。結(jié)果顯示，DENV-2病毒空殼所激發(fā)的抗體與天然病毒所激發(fā)的抗體具備相似的中和能力，其中DENV-2病毒空殼誘導(dǎo)的抗體在中和50%DENV-2感染能力(50%Focus Reduction Neutralizing Test, FRNT50)時(shí)的滴度為102.314(LogFRNT50=2.314)，與天然DENV-2所激發(fā)抗體的中和能力相似(LogFRNT50=2.389)。在對(duì)DENV-1感染時(shí)的中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DENV-2病毒空殼所激發(fā)抗體的中和能力(LogFRNT50=1.696)也與天然DENV-2一致(LogFRNT50=1.717)。對(duì)免疫后血清增強(qiáng)DENV-1感染能力的研究結(jié)果中顯示，病毒空殼所激發(fā)抗體在高濃度時(shí)的ADE活性較天然病毒所激發(fā)抗體略強(qiáng)，這推斷是由于在高濃度抗體情況下，天然病毒所激發(fā)的中和抗體與非中和抗體都對(duì)病毒感染產(chǎn)生了阻礙作用。當(dāng)隨著抗體濃度的降低，免疫DENV-2天然病毒所激發(fā)抗體的ADE活性迅速增強(qiáng)，最高可使DENV-1增加56％的感染能力，而免疫DENV-2病毒空殼后，抗體的ADE活性此時(shí)沒有隨著抗體濃度的降低而迅速增加，最高使DENV-1感染能力增加46％。通過對(duì)免疫后抗體的中和活性以及ADE活性的結(jié)果分析顯示，免疫DENV-2病毒空殼后可激發(fā)與DENV-2天然病毒一致的中和抗體，但ADE活性卻較免疫天然病毒抗體有所降低。 3. DENV-2病毒空殼所激發(fā)抗體的免疫保護(hù)能力。由于缺乏致病動(dòng)物模型，本文對(duì)免疫保護(hù)能力的研究采用了在體外將抗體與病毒孵育，再對(duì)乳鼠進(jìn)行顱內(nèi)注射的方法對(duì)免疫保護(hù)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，當(dāng)將免疫DENV-2病毒空殼血清與DENV-2在體外孵育1h后再進(jìn)行顱內(nèi)注射，大部分小鼠可以存活，并沒有發(fā)生神經(jīng)性病變。對(duì)乳鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，免疫DENV-2病毒空殼后血清可抵抗5×104PFU和1×105PFU兩個(gè)滴度的DENV-2感染，1:40及1:80稀釋的免疫血清都可以對(duì)乳鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)能力。在5×104PFU和1×105PFU的DENV-1感染實(shí)驗(yàn)組中，1:80稀釋的DENV-2病毒空殼免疫血清對(duì)小鼠的保護(hù)力減弱，1:40稀釋的免疫血清組還具有免疫保護(hù)能力。結(jié)果說明DENV-2病毒空殼免疫后，對(duì)DENV-2的感染有較好的免疫保護(hù)能力，在抗體濃度較高的情況下，對(duì)DENV-1的感染也具有良好的免疫保護(hù)作用。 4.規(guī)�；歉锊《局苽渑c純化方法建立。本文通過低血清馴化方法得到了在2％血清濃度下生長(zhǎng)的單克隆Vero細(xì)胞系。通過鑒定及篩選制備了2％低血清濃度下生長(zhǎng)的用于培養(yǎng)登革病毒的單克隆Vero細(xì)胞系。所建立的細(xì)胞系細(xì)胞復(fù)蘇效率達(dá)90.8％，培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，傳代周期為3d。在培養(yǎng)DENV-2病毒時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)豐度為80％，病毒接種量為0.05-0.1個(gè)MOI時(shí)可進(jìn)行質(zhì)量穩(wěn)定的病毒大規(guī)模培養(yǎng)，病毒培養(yǎng)時(shí)間為72-96h，收毒后病毒滴度為4×105PFU/mL。本文利用硫酸銨與PEG1000建立雙水相體系，通過萃取方法可將DENV-2及PRRSV兩種不同病毒從含病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清中萃取到富含PEG1000的上相。病毒原液經(jīng)過雙水相萃取純化并濃縮后，體積濃縮至原體積的20.9％。蛋白電泳檢測(cè)無雜蛋白，通過TCID50檢測(cè)病毒滴度達(dá)106.7TCID50/mL，PFU滴度達(dá)7×106PFU/mL。本文所建立的硫酸銨/PEG1000雙水相體系可成功應(yīng)用于登革病毒的大規(guī)模濃縮與純化。 5.規(guī)�；歉锊《究諝ぶ苽浞椒ńⅰＳ肏NE緩沖液調(diào)整病毒蛋白濃度為2mg/mL后用終濃度0.3mg/mLTriton X-100對(duì)病毒顆粒進(jìn)行裂解，通過Sepharose4FF分子篩層析分開溶解的病毒包膜與病毒核心，再經(jīng)超濾透析去除Triton X-100后病毒空殼可自動(dòng)組裝。所制備的病毒空殼磷脂回收率為68.5％，蛋白回收率為58.6％，蛋白/磷脂比為1.84, Triton X-100殘留5.3%。經(jīng)鑒定，該大規(guī)模方法制備的DENV-2病毒空殼蛋白電泳檢測(cè)都無雜蛋白存在，透射電鏡檢測(cè)病毒空殼呈理論大小。同時(shí)，本文所建立的大規(guī)模病毒空殼制備方法可代替實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備方法，同時(shí)該方法可應(yīng)用與其他病毒空殼生產(chǎn)。 6.登革病毒空殼制備的中試工藝設(shè)計(jì)。本文在解決了制備DENV-2病毒空殼所需大量高純度病毒、以及在大規(guī)模條件下制備病毒空殼的難點(diǎn)后，對(duì)DENV-2病毒空殼的制備工藝進(jìn)行了設(shè)計(jì)與優(yōu)化，并以此工藝進(jìn)行了中試生產(chǎn)。建立了一套生產(chǎn)技術(shù)路線，將DENV-2病毒空殼的制備過程量化為細(xì)胞培養(yǎng)、生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)、病毒半成品制備、病毒空殼半成品制備、疫苗成品制備5個(gè)過程。經(jīng)過對(duì)工藝進(jìn)行量化及工序同期化的統(tǒng)籌后，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)節(jié)負(fù)責(zé)生產(chǎn)用Vero細(xì)胞的復(fù)蘇，每次提供3×107個(gè)細(xì)胞。生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)節(jié)剛好用3×107個(gè)細(xì)胞接種一瓶15L轉(zhuǎn)瓶，并負(fù)責(zé)制備培養(yǎng)病毒用的單層細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶。之后病毒半成品環(huán)節(jié)一次產(chǎn)出500mL蛋白濃度為2mg/mL的登革病毒，剛好用于一次病毒空殼制備。病毒空殼制備環(huán)節(jié)每次產(chǎn)出蛋白濃度為2mg/mL的病毒空殼100mL。所設(shè)計(jì)的生產(chǎn)技術(shù)路線每個(gè)環(huán)節(jié)都可獨(dú)立運(yùn)轉(zhuǎn)，源源不斷的向下一環(huán)節(jié)提供需求。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

革病毒疫苗研發(fā)面臨的困境，理想的登革病毒疫苗應(yīng)能對(duì)四種亞型登革病毒都產(chǎn)生免疫保護(hù)能力。在能對(duì)抗四種登革病毒的同時(shí)，還應(yīng)具有可以激發(fā)長(zhǎng)效、平衡免疫保護(hù)的能力[9, 10, 13-16]。1.1 登革病毒空殼研究前景1.1.1 登革病毒背景登革病毒以白伊蚊為主要傳播媒介，流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)的 100 多個(gè)國(guó)家之中，是危害較大的一種蟲媒病毒[16]。DENV 病毒基因組長(zhǎng) 11kb，含有一條單一開放讀碼框，共編碼 3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM、E)和 7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白((NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、 NS5)。登革病毒顆粒呈球形，直徑約 45-55nm，病毒顆粒含脂蛋白包膜，并鑲嵌有糖蛋白 E 和 M。其中 E 基因編碼的 E 蛋白是病毒包膜的主要糖蛋白，分子量約為 51-60kD，含有多種 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞抗原表位并具有多種生物學(xué)功能，如結(jié)合靶細(xì)胞表面受體、介導(dǎo)膜融合、誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體、紅細(xì)胞凝集等，是登革病毒的主要保護(hù)性抗原[17, 18]。

同時(shí)在 DENV 的致病和免疫過程中起著至關(guān)重要的作用。結(jié)構(gòu)域 ED III 為 IgG 免疫球蛋白樣折疊，具備誘導(dǎo)中和抗體表位及亞型特異性抗原表位，而沒有誘導(dǎo)產(chǎn)生非中和抗體與交叉反應(yīng)抗體的抗原表位。所以以 ED III 作為抗原免疫機(jī)體，可以降低 ADE 現(xiàn)象的產(chǎn)生，但同時(shí)也缺少了交叉保護(hù)能力。因?yàn)?E 蛋白是病毒的主要表面蛋白，存在主要的中和位點(diǎn)，因此登革熱病毒 E 蛋白作為理想的抗原將很可能成為具備臨床應(yīng)用價(jià)值的登革病毒疫苗，目前以各種載體表達(dá)獲得的 E 蛋白亞單位疫苗尚在研發(fā)中[21]。

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6 記者 吳玲娟;我國(guó)登革熱疫情平穩(wěn)[N];保健時(shí)報(bào);2007年

7 夏文俊邋記者 曾星;“五一”赴印尼等國(guó)旅行需防范登革熱[N];中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào);2007年

8 記者 孫夢(mèng);登革熱診療指南發(fā)布[N];健康報(bào);2014年

9 廣州市登革熱臨床救治專家組組長(zhǎng) 張復(fù)春 整理 王寧;重癥登革熱治療須謹(jǐn)慎[N];健康報(bào);2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 杭小同;登革病毒感染診斷方法的研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2010年

2 肖維威;登革病毒檢測(cè)基因芯片的研制研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 張志珊;1-4型登革病毒外膜蛋白基因DⅢ區(qū)的表達(dá)及其在血清學(xué)診斷和免疫保護(hù)方面的應(yīng)用研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2007年

4 田衍平;還原型谷胱甘肽在登革病毒增殖中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

5 姬廣輝;無感染增強(qiáng)的廣譜抗登革病毒中和抗體的構(gòu)建及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

6 朱武洋;衣殼蛋白基因突變對(duì)登革病毒生物學(xué)性質(zhì)的影響[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

7 曹政;登革病毒空殼疫苗研制及病毒空殼制備關(guān)鍵技術(shù)[D];重慶大學(xué);2014年

8 涂增;蟲媒登革病毒（Mosquito-borne dengue viruses）基因組進(jìn)化與分子診斷的研究[D];西南大學(xué);2009年

9 尉雁;登革2型病毒基因組3’非編碼區(qū)對(duì)翻譯的調(diào)控作用[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

10 楊永紅;登革Ⅱ型病毒EDⅢ與登革病毒受體蛋白的鑒定及功能評(píng)價(jià)[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 潘京;蚊蟲細(xì)胞與蚊蟲組織中登革病毒受體分子篩選與鑒定[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

2 黃艷芬;登革病毒包膜蛋白Ⅲ區(qū)單抗中和作用與作用機(jī)制研究以及登革病毒初次感染患者血清中和抗體反應(yīng)分析[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

3 陳煒;微管骨架在登革病毒感染中作用的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

4 胡勇;廣東和廣西部分地區(qū)蝙蝠攜帶登革病毒及流行性乙型腦炎病毒的調(diào)查研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

5 貢樹基;登革病毒感染性轉(zhuǎn)錄體技術(shù)新途徑的初步研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

6 朱小娟;登革病毒在宿主選擇壓力下基因組核苷酸變異與毒力的相關(guān)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

7 溫筱蕓;細(xì)胞因子在登革病毒感染人皮膚成纖維細(xì)胞中的作用[D];暨南大學(xué);2004年

8 肖瑞;登革病毒對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)的影響[D];暨南大學(xué);2006年

9 秦成峰;登革病毒衣殼蛋白靶向抗病毒作用的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

10 岳磊;登革病毒復(fù)制子反式包裝系統(tǒng)的建立[D];暨南大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2722093