【摘要】：背景:感染性疾病是臨床上的常見病,發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢,嚴重的感染患者會發(fā)生感染性休克。不同類型的感染性疾病的治療方案也不同,細菌感染需要及時采用抗生素進行治療,非細菌性感染則應慎用抗生素治療。膿毒血癥是一種死亡率較高的疾病,是非心臟內(nèi)科ICU病人死亡的主要原因,我國估計約300萬例/年,死亡率40%-50%。不能接受有效的抗生素治療,患者的死亡風險逐漸上升,每推遲一小時,死亡率將增加7.6%。因此對這些感染性疾病進行早期的鑒別診斷,選擇合適的治療方案顯得非常重要。降鈣素原(procalcitonin,PCT)作為膿毒血癥、炎癥的一個良好血清學標志物,有助于臨床感染性疾病的鑒別診斷及其預后評估,指導抗生素使用。目前PCT的檢測方法主要有定量法(化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫發(fā)光分析法)和半定量法(膠體金法)�；瘜W發(fā)光法、酶聯(lián)免疫發(fā)光分析法能準確定量,化學發(fā)光法需要大型專用儀器、費用昂貴、使用不便,酶聯(lián)免疫發(fā)光分析法操作繁瑣,準確性影響因素較多等缺點,限制了使用范圍。膠體金法快速簡便,但是不能精確的定量。PCT的動態(tài)監(jiān)測和早期檢測在臨床上的價值意義重大,因此需要建立一種能快速、簡便、準確對PCT定量的方法。目的:建立一種適用于床旁檢測(Point of care testing,POCT)又稱為“即時檢驗”的快速定量檢測方法以助于PCT的及時檢測和動態(tài)監(jiān)測。本研究采用時間分辨結合免疫層析技術,建立一種快速定量檢測PCT的方法。方法:1.將購買的兩對PCT特異性單克隆行標記和包被抗體配對組合,用時間分辨免疫熒光分析法(TRFIA,Time-resolved fluoroimmunoassay)進行篩選,獲取最佳的標記及包被抗體。2.應用雙抗體夾心法,建立基于時間分辨熒光免疫層析快速定量檢測降鈣素原(PCT)試劑的方法。對各項試劑參數(shù)進行優(yōu)化包括:硝酸纖維膜(NC膜)的篩選、檢測線(T)和質控線(C)包被抗體量、最佳的劃線量、標記抗體最佳用量、最佳反應時間確定。3.對試劑性能指標評估,進行以下實驗:標準曲線、分析靈敏度、準確度、精密度、特異性、臨床考核實驗。結果:1.通過TRFIA法,綜合劑量-反應曲線相關系數(shù)(r)、信噪比、背景等,篩選最優(yōu)的標記原料(MJ03);包被原料(16B5)。2.確立基于免疫層析技術與時間分辨技術反應模式;最佳的硝酸纖維膜HF135膜;檢測線(T)16B5最佳包被用量2.0mg/mL;質控線(C)山羊抗兔IgG最佳包被用量1.0mg/mL;最優(yōu)劃線噴速0.08μL/mm;標記抗體MJG03最佳用量為0.1mg/mL;兔IgG最佳用量為0.1mg/mL;最佳反應時間為15min。3.試劑性能指標評估:標準曲線回歸方程:log(y)= 1.1143+0.8529log(x),r=0.9994;分析靈敏度為0.08ng/mL;準確度(回收率)在93%～105%之間;分析、分析間精密度CV在5.4%～13.4%;檢測樣本時不受人降鈣素、CRP、人抗鈣素、IL-6干擾物質的影響;234例臨床樣本考核實驗等效性對比研究表明,自制試劑盒和商品化試劑盒(Roche Elecsys BRAHMS PCT Kit)具有很好的一致性(Kappa =0.875)和相關性[r = 0.977,(P0.01)]。結論:本研究成功研制了基于時間分辨熒光免疫層析技術快速定量檢測PCT的試劑,試劑各項參數(shù)、性能指標良好,均符合體外診斷試劑的要求。能很好的滿足臨床對PCT快速定量檢測的需求。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

長和發(fā)射波長間Ｓｔｏｃｋｓ位移較大。利用光譜分辨技術和時間分辨技術可有效減逡逑少外界焚光、激發(fā)光及非特異性焚光的干擾，增強檢測儀器的靈敏度。Ｅｕ３＋的主逡逑要特征：Ｓｔｏｃｋｓ位移較大（見圖２），圖上所見Ｅｕ３＋的激發(fā)波長峰值為３３７ｎｍ，逡逑發(fā)射波長峰值為６１３ｎｍ，邋Ｓｔｏｃｋｓ位移達到２７６ｎｍ，而普通熒光物質的Ｓｔｏｃｋｓ位逡逑移只有幾十納米，激發(fā)光與發(fā)射光發(fā)生部分重疊，引起相互干擾。熒光持續(xù)時間逡逑長（見圖３），Ｅｕ３＋螯合物的熒光衰變時間較長，可以達到數(shù)百微秒，而普通熒光逡逑基團只有１？１００l(fā)�，待测样本中一些蛋白荧桂}倜芏�，仅有１？１０哗。蕦嵄延辶x銑儼飭渴奔�，可消除蛋皧y塵壩獾母扇�，实现高信噪饼x獗Ｖち聳奔浞直嬗義瞎夥治黽際醯母吡槊舳群偷透扇擰Ｊ奔浞直嬗夥治黽際酰ǎ裕遙校桑粒┘扔蟹派涿忮義弦叻治黽際酰ǎ遙桑粒┑母吡槊舳齲鐘杏獗曇敲庖叻治觶ǎ疲桑粒┎僮骷蟣�，快辶x轄葑遠扔諾�，灾G錆土俅擦煊蠐泄憷那熬�。辶x纖孀偶觳餳際醯姆⒄

本文編號：2721512