【摘要】：目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病,在我國發(fā)病率和致殘率均很高,嚴重降低患者生活質(zhì)量。RA現(xiàn)階段治療以抗炎及免疫抑制為主,但其明顯的毒副作用嚴重影響治療效果,且易產(chǎn)生耐藥性。因此深入探索RA并開發(fā)出新的治療藥物對于防治RA有著重要的理論意義及極大的臨床價值。既往研究表明LDN通過與阿片受體結(jié)合調(diào)節(jié)T/B淋巴細胞增殖、巨噬細胞和DCs的功能與分化及相應(yīng)炎性細胞因子的產(chǎn)生,從而對纖維多肌痛、多發(fā)性硬化、克羅恩病等自身免疫疾病發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,減輕病情嚴重程度達到臨床緩解的目的。據(jù)報道LDN在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)緩解關(guān)節(jié)炎癥程度方面是有效的,但目前其療效與具體機制并不十分明確,有待于未來進一步深入探索。因此本實驗擬通過大鼠CIA關(guān)節(jié)炎模型實驗,從以下三方面進行研究:1.不同濃度的納曲酮體內(nèi)腹腔注射,研究LDN是否可以減輕大鼠關(guān)節(jié)炎癥及何種劑量LDN對緩解關(guān)節(jié)炎癥的作用最為顯著。2.研究LDN是以何種機制發(fā)揮其調(diào)節(jié)免疫減輕炎癥的作用:是否與調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群、Th細胞亞群-Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、Treg細胞間的相互平衡關(guān)系及大鼠外周血清中細胞因子環(huán)境有關(guān)。3.探究LDN調(diào)控Th細胞分化及炎癥細胞因子表達和局部減輕關(guān)節(jié)軟骨及骨組織損傷的具體機制。上述研究為LDN可能作為單獨應(yīng)用或輔助治療等方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用緩解關(guān)節(jié)炎嚴重程度奠定堅實理論基礎(chǔ),可能對傳統(tǒng)控制病情藥物及生物制劑未見到明顯療效的RA患者提供一個新的治療方法。研究方法:1.取70只3-4周齡(體重100g左右)的雌性wistar大鼠,隨機分為6組,除空白對照組10只,其余均建立CIA關(guān)節(jié)炎模型并剔除造模未成功者,保證每組至少10只,隨機選取一組為CIA對照組,余下4組每天分別予以不同劑量的NTX:1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg及20mg/kg,觀察大鼠體毛色澤及其活動狀態(tài),稱量并記錄體重,依據(jù)關(guān)節(jié)腫脹及活動等情況評估及記錄大鼠關(guān)節(jié)病變的嚴重程度;4周后處死大鼠取膝關(guān)節(jié)滑膜及后足踝關(guān)節(jié),HE染色觀察病理學(xué)變化并進行評分明確炎癥損傷程度。2.明確LDN在大鼠CIA關(guān)節(jié)炎模型中減輕炎癥的作用及確定最佳作用濃度后,提取各組大鼠脾內(nèi)淋巴細胞,應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測大鼠脾臟組織內(nèi)淋巴細胞亞群的數(shù)量及變化:CD4~+/CD8~+T細胞,Th1/Th2細胞和Th17/Treg細胞;同時取大鼠的外周血清,應(yīng)用ELISA方法檢測外周血清中細胞因子TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12及IL-17的表達水平變化情況。3.前期實驗表明LDN可調(diào)節(jié)T細胞平衡及炎癥細胞因子的釋放,本實驗進一步探索在不同組織中LDN與何種阿片類受體相互作用介導(dǎo)何種下游信號通路調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)減輕局部關(guān)節(jié)炎癥的。應(yīng)用實時PCR及免疫組化染色方法檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中阿片受體MOR、KOR及DOR的mRNA及蛋白的表達情況,實時PCR及蛋白免疫印跡方法檢測大鼠脾臟組織中阿片受體MOR、KOR及DOR的mRNA及蛋白的表達情況,且進一步通過蛋白免疫印跡方法檢測大鼠脾臟及關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、RANKL及NF-κB的蛋白表達情況來探索調(diào)節(jié)全身免疫反應(yīng)減輕局部炎癥的作用機制。結(jié)果:1.LDN給藥組中10mg/kg組體重與健康對照組相比減輕最少,與其余給藥組和CIA組相比有所增加,關(guān)節(jié)炎炎癥較其余給藥組和CIA組減輕,滑膜及關(guān)節(jié)組織HE染色評分最低,故提示一定濃度的LDN可緩解大鼠關(guān)節(jié)炎的嚴重程度,并且以濃度為10mg/kg劑量時作用最佳,關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥程度最輕。2.在10mg/kg給藥組中,流式細胞術(shù)提示大鼠脾臟淋巴細胞中CD4~+T細胞增多,CD8~+T細胞減少,CD4~+/CD8~+T細胞比例上升;Th1細胞減少,Th2細胞增多,Th1/Th2比例降低;Th17細胞減少,Treg細胞增多,Th17/Treg比例降低;而外周血清中細胞因子TNF-α、IL-6、IL-12及IL-17表達降低,細胞因子IL-10表達增加;提示一定濃度的LDN可調(diào)節(jié)T淋巴細胞及Th細胞亞群的平衡調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)重建免疫耐受減輕炎癥,并且可以降低大鼠外周血清中促炎癥細胞因子的表達,增加抑制炎癥細胞因子釋放從而緩解病情;進而進一步驗證LDN濃度為10mg/kg時作用時效果最佳。3.結(jié)果提示脾臟中MOR與DOR高表達,關(guān)節(jié)滑膜組織中高表達KOR和DOR;脾臟及滑膜組織中雖然與健康對照組相比TLR4表達增加,但在LDN給藥組中TLR4表達與CIA組相比明顯下降,提示LDN與脾臟及滑膜組織中相應(yīng)阿片受體相結(jié)合抑制TLR4表達從而減輕炎癥反應(yīng)的;脾臟及滑膜中NF-κB的表達與CIA組相比有著顯著降低,而與健康對照組相比表達則增強;且關(guān)節(jié)滑膜組織中的RANKL表達也與CIA組相比有著顯著降低,與健康對照組相比表達則增強,提示LDN可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減少促炎癥細胞因子分泌以及調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡抑制Th17分化從而調(diào)節(jié)全身免疫反應(yīng)減輕炎癥;同時在關(guān)節(jié)滑膜組織中LDN可能通過抑制TLR4表達抑制下游RANKL最終介導(dǎo)NF-κB信號通路減少破骨細胞分化降低關(guān)節(jié)中骨及軟骨組織的侵蝕程度。結(jié)論:1.LDN可緩解大鼠關(guān)節(jié)炎的嚴重程度,以濃度為10mg/kg劑量時作用最佳,關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥程度最低;2.LDN可通過調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群:CD4~+/CD8~+T細胞,Th1/Th2細胞和Th17/Treg細胞的平衡,以及降低促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-12及IL-17表達,增加抑炎癥細胞因子IL-10表達,進而調(diào)節(jié)免疫重建免疫耐受減輕炎癥反應(yīng)。3.LDN在脾臟中可能與MOR與DOR相結(jié)合制TLR4/NF-κB信號通路減少促炎癥細胞因子分泌以及調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡抑制Th17分化從而調(diào)節(jié)全身免疫反應(yīng)減輕炎癥;同時可能與關(guān)節(jié)滑膜組織中KOR和DOR結(jié)合通過抑制TLR4/RANKL/NF-κB信號通路減少破骨細胞分化減輕關(guān)節(jié)中骨及軟骨組織的侵蝕程度。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R593.22;R-332
【圖文】：

圖 2 A：健康對照組，B：CIA 造模組圖 3 關(guān)節(jié)炎評分變化3.3 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化0 2681 01 21 41 63 4 5 6 7A I s c o r i n gw e e kscore1 m g / k g5 m g / k g1 0 m g / k g2 0 m g / k gC I ADifferences betweengroupspvalue1mg/kg vs CIA --5mg/kg vs CIA p<0.0510mg/kg vs CIA p<0.0520mg/kg vs CIA p<0.055mg/kg vs 10mg/kg p<0.05

圖 5 大鼠踝關(guān)節(jié) HE 染色，A-B 分別為 1mg/KG 組 50 倍 100 倍視野，C-D 為 5mg/KG 組同理，E-F 為 10mg/KG 組同理，G-H 為 20mg/KG 組同理，I-J 為 CI 造模組同理，K-L 為空對照組同理表 3 關(guān)節(jié) HE 染色評分第三周 第四周 第五周 第六周1mg/kg 組 2.3±0.67 3.4±0.52 4.7±0.48 5.8±0.425mg/kg 組 1.1±0.48 2.3±0.70 3.9±0.67 5.0±0.7010mg/kg 組 0.8±0.63 2.0±0.67 3.5±0.71 4.2±0.7920mg/kg 組 1.3±0.57 2.4±0.67 3.7±0.57 4.6±0.67CIA 對照組 1.8±0.79 3.0±0.47 4.4±0.70 5.5±0.536H E S c o r i n g56H E S c o r i n g1 m g / k g5 m g / k g

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本文編號：2719756