【摘要】：目的:完成大鼠FcγRIIB慢病毒誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建,并且對大鼠FcγRIIB慢病毒誘導(dǎo)表達(dá)載體在HT-1080細(xì)胞表面是否能夠穩(wěn)定、可控地表達(dá)進(jìn)行檢驗(yàn),并開始對FcγRIIB慢病毒誘導(dǎo)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染不成熟樹突狀細(xì)胞后,對其抗原呈遞功能的影響進(jìn)行研究。方法:以Lewis大鼠m RNA為模版逆轉(zhuǎn)錄獲得FcγRIIB基因片段,在慢病毒表達(dá)質(zhì)粒TRE中克隆插入FcγRIIB基因片段,完成FcγRIIB慢病毒表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。使用FcγRIIB慢病毒表達(dá)重組質(zhì)粒與Lenti-X HTX慢病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,收獲表達(dá)病毒。將慢病毒調(diào)節(jié)質(zhì)粒Tet-on3G與Lenti-X HTX包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,收獲調(diào)節(jié)病毒。表達(dá)病毒和調(diào)節(jié)病毒共感染HT-1080細(xì)胞,免疫熒光觀察HT-1080細(xì)胞,在強(qiáng)力霉素(Dox)梯度濃度的誘導(dǎo)下FcγRIIB的表達(dá)。培養(yǎng)DA大鼠骨髓來源不成熟樹突狀細(xì)胞(Immature dendritic cell imDC),流式細(xì)胞檢測經(jīng)過免疫磁珠分選的imDC的純度;流式細(xì)胞檢測磁珠分選后imDC表面共CD80、CD86、CD40、MHC-II表達(dá)量。表達(dá)病毒與調(diào)節(jié)病毒共感染imDC,并加入不同濃度Dox對imDC誘導(dǎo),免疫熒光染色觀察imDC細(xì)胞表面FcγRⅡB的表達(dá);流式細(xì)胞檢測轉(zhuǎn)染后imDC細(xì)胞表面FcγRIIB的表達(dá)率;Western blot法在轉(zhuǎn)錄后蛋白水平對FcγRIIB的表達(dá)進(jìn)行檢測,流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后imDC表面CD80、CD86、CD40、MHC-II在細(xì)胞表面表達(dá)。結(jié)果:利用PCR、多克隆位點(diǎn)酶切及DNA測序技術(shù)對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定,測序結(jié)果表示目的片段DNA序列與Gene Bank顯示的FcγRIIB基因序列經(jīng)過Blast比對同源性達(dá)100%。病毒感染后的HT-1080細(xì)胞,經(jīng)Dox誘導(dǎo)表達(dá)FcγRIIB,免疫熒光檢測數(shù)據(jù)顯示,慢病毒載體可以使目的基因FcγRIIB在HT-1080細(xì)胞可控地表達(dá)。不成熟樹突狀細(xì)胞磁珠分選后流式檢測結(jié)果:OX62陽性表達(dá)率:93%;流式檢測細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40、MHC-II陽性表達(dá)率分別是11.6%、11.48%、9.25%、12.35%。免疫熒光結(jié)果驗(yàn)證了imDC細(xì)胞經(jīng)過病毒轉(zhuǎn)染后,能夠上調(diào)FcγRIIB在其表面的表達(dá);流式細(xì)胞檢測FcγRIIB表達(dá)水平與誘導(dǎo)劑劑量正相關(guān);Western blot法結(jié)果顯示FcγRIIB蛋白表達(dá)水平隨誘導(dǎo)劑劑量增加而升高;流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)慢病毒轉(zhuǎn)染imDC后細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40、MHC-II類分子陽性表達(dá)率分別為6.44%、8.25%、5.38%、11.62%。結(jié)論成功構(gòu)建了FcγRIIB慢病毒誘導(dǎo)表達(dá)載體。慢病毒感染大鼠骨髓來源不成熟樹突狀細(xì)胞后過表達(dá)FcγRIIB基因,并且能夠下調(diào)不成熟樹突狀細(xì)胞的抗原提呈作用。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R346;R392
【圖文】：

pLVX-TRE3G質(zhì)粒物理圖譜

TRE-FcγRIIB重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒測序結(jié)果與GeneBankFcγRIIB序列的Blast比對結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭修軍;王琦;曹秀琴;楊志偉;;上調(diào)巨噬細(xì)胞FcγRⅡB的表達(dá)可抑制其吞噬和趨化功能[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年08期

2 孫卉;馬海峰;曹秀琴;楊志偉;;上調(diào)小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞FcγRⅡb表達(dá)可抑制其抗原提呈功能[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年05期

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本文編號：2719662