【摘要】：研究背景和目的 巨噬細(xì)胞在人類(lèi)免疫系統(tǒng)中占有獨(dú)特的位置,它是免疫系統(tǒng)第一個(gè)被確定的細(xì)胞成分,在機(jī)體正常生理過(guò)程和病理過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用。它在機(jī)體遭受損傷或者感染狀態(tài)時(shí),第一個(gè)到達(dá)病患處發(fā)揮重要的作用,是機(jī)體中重要的吞噬和抗原提呈細(xì)胞。臨床研究及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)巨噬細(xì)胞在急性炎癥(如感染,敗血癥等)和慢性炎癥(胰島素抵抗,動(dòng)脈粥樣硬化,慢性損傷,腫瘤的形成等)均起到關(guān)鍵性作用。全身各處的巨噬細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞,破骨細(xì)胞均來(lái)源于外周循環(huán)中的單核細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是在細(xì)胞因子的刺激下由骨髓干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)。在多集落刺激因子(multi-CSF,multi Colony Stimulating Factor)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF,Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor)等刺激下,由骨髓干細(xì)胞發(fā)育成單核母細(xì)胞,后者進(jìn)一步分化成為前單核細(xì)胞并進(jìn)人外周血流,并在此處分化成為成熟的單核細(xì)胞。很多因素如前炎癥狀態(tài),代謝,免疫都可以促使單核細(xì)胞向外周組織聚集,分化為巨噬細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)宿主防御,機(jī)體自我修復(fù)與重塑等功能。 我們知道免疫效應(yīng)細(xì)胞在免疫反應(yīng)中并不是表型單一的活化細(xì)胞,在不同的微環(huán)境因素影響下,活化的細(xì)胞可以分化為不同表型的亞細(xì)胞型,這些亞型細(xì)胞不但適應(yīng)局部微環(huán)境同時(shí)又是局部微環(huán)境不可缺少的組分�；趯�(duì)Th細(xì)胞的極化的研究基礎(chǔ)上,越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注巨噬細(xì)胞的極化現(xiàn)象。 目前研究發(fā)現(xiàn),在不同的環(huán)境中,巨噬細(xì)胞可以分化為行使特定免疫功能的不同細(xì)胞亞群。巨噬細(xì)胞主要分為兩種類(lèi)型：由TH1型反應(yīng)引起的IFN-γ依賴(lài)的經(jīng)典途徑激活的MI型巨噬細(xì)胞,即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage),其可直接吞噬和殺傷病原微生物和腫瘤細(xì)胞,分泌促炎因子和趨化因子,并通過(guò)遞呈抗原參與正向免疫應(yīng)答,發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能和宿主防御的功能；由TH2型細(xì)胞因子、IL-4與IL-13引起的替代途徑激活的M2型巨噬細(xì)胞,即替代性活化的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage)。其可在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF,Macrophage Colony-Stimulating Factor) IL-4、IL-13、IL-10、糖皮質(zhì)激素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、維生素D3和前列腺素E2(PGE2)等作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生,其抗原遞呈能力較低,并通過(guò)分泌IL-10、CCL17、CCL18、CCL22和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子下調(diào)免疫應(yīng)答。促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)和纖維變性。M2型巨噬細(xì)胞同腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系,腫瘤中的巨噬細(xì)胞主要是經(jīng)微環(huán)境“教化”后的M2型巨噬細(xì)胞,具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。同時(shí)大量研究證實(shí)M2型巨噬細(xì)胞可以減輕胰島素抵抗,改善寄生蟲(chóng)感染,重塑脂肪組織,減輕體重。 MicroRNAs (miRNAs)是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的、長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸的、非編碼單鏈小分子RNA,它們通過(guò)結(jié)合到靶基因的mRNA上,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),對(duì)增殖,分化,凋亡等基本細(xì)胞過(guò)程具有重要的調(diào)控作用。 目前越來(lái)越多的證據(jù)表明：microRNA(miRNA)參與了免疫調(diào)控,與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的分化和功能維持關(guān)系密切,許多miRNAs在免疫反應(yīng)中扮演著十分重要的角色。如研究證實(shí)TLR4配體脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激后,可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6,白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1,來(lái)實(shí)現(xiàn)miR-146a在單核細(xì)胞中表達(dá)明顯升高；在先天性免疫應(yīng)答方面,miR-146a表達(dá)升高是內(nèi)毒素耐受的重要表現(xiàn)之一。細(xì)菌病毒相關(guān)抗原可以激活TLR4,TLR2,TLR3或者TLR9等,進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)miR-155。已經(jīng)證實(shí)miR-155在免疫反應(yīng)中既可以發(fā)揮促進(jìn)免疫反應(yīng)也可以表現(xiàn)出抑制免疫反應(yīng)的作用。經(jīng)LPS刺激后單核細(xì)胞可以表達(dá)miR-21,上調(diào)miR-21的表達(dá)可以抑制LPS所誘導(dǎo)的NF-κB調(diào)控的活化以及IL-6的表達(dá),但可以提高IL-10的表達(dá),同時(shí)miR-21可以通過(guò)TLR7和TLR8誘發(fā)免疫激活。 在各種miRNAs中,miR-10b引起了我們極大的興趣。目前的研究主要致力于miR-10b同腫瘤之間的關(guān)系。miR-10b對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用是由Ma和同事等首次提出的。他們的研究發(fā)現(xiàn)miR-10b可以在高轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá),阻斷miR-10b能夠使MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力下降90%以上,而不具備轉(zhuǎn)移能力的SUM149細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-10b后,在裸鼠體內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。臨床資料也表明,發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者,miR-10b表達(dá)高于非轉(zhuǎn)移組。此外,Gabriely等的研究證明了在體外,抑制miR-10b的表達(dá)可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期和凋亡,從而抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。并且與含miR-10家族水平低的膠質(zhì)瘤患者相比,含miR-10家族水平高的患者其存活率明顯降低。與注射安慰劑組相比,人膠質(zhì)瘤小鼠模型在注射miR-10b抑制劑后,其腫瘤生長(zhǎng)明顯下降。這些均證明了miR-10b對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。 Kruppel樣因子4(Klf4或稱(chēng)腸道富集的Kruppel樣因子)是屬于Kruppel蛋白家族的一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。Klf4具有多種生理功能,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中Klf4基因具有抑癌基因和癌基因的雙重功能,可以影響細(xì)胞周期的調(diào)控、凋亡以及細(xì)胞分化。相當(dāng)一部分研究發(fā)現(xiàn)在多種人類(lèi)腫瘤,包括食管癌,胃癌,大腸癌和膀胱癌,Klf4的表達(dá)經(jīng)常發(fā)生缺失,這提示其可能具有抑癌作用。據(jù)報(bào)道,Klf4可抑制多種癌癥轉(zhuǎn)移的發(fā)生,如大腸癌、食管癌、胰腺癌細(xì)胞等。并且在大腸癌中,Klf4可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯抑制細(xì)胞增殖；通過(guò)影響細(xì)胞增殖、凋亡和癌細(xì)胞的浸潤(rùn),從而調(diào)節(jié)食管癌的發(fā)生。綜合考慮上述結(jié)論,Klf4在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖過(guò)程中可能起抑癌基因的作用,這恰恰與miR-10b發(fā)揮的癌基因作用相反。目前已有研究探討miR-10b通過(guò)調(diào)控Klf4,在大腸癌的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)增殖和轉(zhuǎn)移的功能。本課題組在既往研究中構(gòu)建了兩個(gè)含有熒光素報(bào)告基因的質(zhì)粒：Klf43'-UTR和Klf43'-UTR-mut。前者含有Klf4mRNA的全長(zhǎng)3’UTR區(qū)域；后者3’非翻譯區(qū)關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)的第296-300位堿基被其互補(bǔ)堿基替代。在SW620細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染含有Klf43'-UTR或Klf43'-UTR-mut的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒以及miR-lOb inhibitor或相應(yīng)的對(duì)照。結(jié)果顯示,下調(diào)miR-10b的表達(dá)去除了其對(duì)含Klf43'-UTR的熒光素酶活性的抑制作用,提示miR-10b可通過(guò)Klf43'-UTR來(lái)調(diào)節(jié)Klf4基因。而當(dāng)Klf43’-UTR與miR-10b的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變,miR-10b表達(dá)抑制后對(duì)熒光素酶活性產(chǎn)生的作用將會(huì)受到影響。證實(shí)Klf43'UTR從295-301位核苷酸可以與miR-10b的5’端關(guān)鍵位點(diǎn)結(jié)合,并進(jìn)一步證實(shí)Klf4是miR-10b的直接靶基因。 在巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)中,Klf4、Klf2、Klf1和Klf3被報(bào)道與單核巨噬細(xì)胞的分化或激活有關(guān)。其中研究得比較多的是Klf4。Klf4在單核細(xì)胞的譜系決定、分化以及激活過(guò)程中都是一個(gè)重要的調(diào)控因子。Klf4-/-嵌合體小鼠中,單核細(xì)胞的分化會(huì)受到嚴(yán)重影響,骨髓中的單核細(xì)胞、脾臟中的單核細(xì)出現(xiàn)大量減少,并且發(fā)現(xiàn)血液中循環(huán)的單核細(xì)胞的幾近消失。Klf4不僅與巨噬細(xì)胞的分化有關(guān),還與巨噬細(xì)胞的激活有關(guān)。最近的研究表明Klf4在M2型巨噬細(xì)胞的分化過(guò)程中具有重要作用。 隨著1889年有學(xué)者提出“種子”與“土壤”假說(shuō),腫瘤微環(huán)境開(kāi)始受到重視,炎癥微環(huán)境已被列為腫瘤十大特征之一,腫瘤與炎癥有著密不可分的關(guān)系,在腫瘤發(fā)展過(guò)程中,局部炎癥環(huán)境促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及基因突變。Klf4不僅參與炎癥反應(yīng)中在單核細(xì)胞的譜系決定、分化、激活過(guò)程,而且作為調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化中都是一個(gè)重要的調(diào)控因子。 綜上所述,我們提出一個(gè)假說(shuō)：miR10b是否能夠通過(guò)調(diào)控KIf4而進(jìn)一步調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化。為了驗(yàn)證這一假說(shuō),我們從如下幾個(gè)方面入手：我們首先觀察miR-10b分別在M1及M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況,分析巨噬細(xì)胞極性改變時(shí)miR-10b在巨噬細(xì)胞的表達(dá)是否有相應(yīng)的變化；通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor和miR-10b mimics,觀察過(guò)表達(dá)miR-10b及抑制miR-10b是否能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化；巨噬細(xì)胞的除具有調(diào)節(jié)固有免疫之外,其中重要的作用是通過(guò)抗原提呈促進(jìn)T輔助細(xì)胞極化調(diào)節(jié)繼發(fā)性免疫,我們進(jìn)一步觀察抑制]miR-10b的表達(dá)能否減弱TH1及TH17細(xì)胞炎癥反應(yīng)；了解抑制miR-lOb是否降低小鼠對(duì)內(nèi)毒素的敏感性及對(duì)細(xì)菌感染的清除能力；而后,采用CD4+CD45RhiT細(xì)胞誘導(dǎo)的腸炎模型模擬人類(lèi)IBD炎癥,觀察抑制miR-10b能否減弱T細(xì)胞所介導(dǎo)的腸炎；最后通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)小鼠中Klf4是miR-10b的靶基因,以探討miR-10b—Klf4這一靶向調(diào)控關(guān)系對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)及其影響,對(duì)TH1及TH17細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。 方法 為了明確miR-10b在M1型巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中是否起到重要作用,我們采集健康志愿者外周靜脈血,采用Ficoll密度梯度離心法,分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,原代培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞,采用GM-CSF(10ng/mL)誘導(dǎo)7天,然后采LPS(100ng/mL)和IFN-γ(20ng/mL)共刺激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化,分別取不同時(shí)間點(diǎn)0、12、24小時(shí),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞中miR-10b的表達(dá)水平。我們也檢測(cè)了在M2極化過(guò)程中miR-10b的表達(dá)水平,原代培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞,采用IL-4(10ng/mL)和IL-13(10ng/mL)共刺激誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞,同樣選擇不同時(shí)間0、12、24小時(shí),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)niR-10b的表達(dá)水平。我們檢測(cè)是否在巨噬細(xì)胞發(fā)生極化改變時(shí),：miR-10b的表達(dá)也隨之發(fā)生變化。同樣,我們分離了人外周血單個(gè)核細(xì)胞,采用GM-CSF(10ng/mL)誘導(dǎo)7天,然后采用LPS(100ng/mL)和IFN-γ(20ng/mL)共刺激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化24小時(shí)后,改用IL-4(10ng/mL)和IL-13(10ng/mL)共刺激24小時(shí),同樣,除去M2型極化因子后,再恢復(fù)M1型極化因子刺激24小時(shí)；然后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-10b的表達(dá)。改變miR-10b的表達(dá)是否影響巨噬細(xì)胞的極化?我們外周血分離出單個(gè)核細(xì)胞,采用GM-CSF誘導(dǎo)7天,分別轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor和miR-10b minic,48小時(shí)后,然后給予GM-CSF(20ng/mL)刺激4小時(shí)誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞,并檢測(cè)M1型和M2型巨噬細(xì)胞特征性因子表達(dá)水平。iNOS是M1型巨噬細(xì)胞特征性因子,而Klf4和IL-4R是M2型特征性因子。采用熒光定量PCR檢測(cè)以上因子mRNA水平。 為了說(shuō)明抑制niR-10b表達(dá)能否減弱了TH1細(xì)胞的反應(yīng)。從C57BL/6小鼠骨髓分離單個(gè)核細(xì)胞,采用GM-CSF(10ng/mL)誘導(dǎo)5天,轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor,繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),加入磁珠分選的小鼠CD4+T細(xì)胞混合培養(yǎng),分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)檢測(cè)TH1轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA表達(dá),ELISA分析IFN-y表達(dá),以及流式分析IFN-y表達(dá)。 同樣為了探討了抑制miR-10b表達(dá)能否減弱了TH17細(xì)胞的反應(yīng)。同上述處理方法一致,分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)檢測(cè)TH17轉(zhuǎn)錄因子RORyt mRNA表達(dá)、ELISA分析IL-17表達(dá),以及流式分析IL-17表達(dá)。 為了進(jìn)一步探討抑制miR-10b是否能明顯抑制M1型極化,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠對(duì)內(nèi)毒素的敏感性的變化。我們采用5%肉湯培養(yǎng)基沖洗小鼠腹腔,收集腹腔巨噬細(xì)胞,將收集的巨噬細(xì)胞種植于60mm培養(yǎng)皿,轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor,按照2x106個(gè)注入小鼠腹腔,并按照1Omg/kg腹腔注射LPS,觀察小鼠生存率；并且收集6血清。采用ELISA法檢測(cè)血清中IL-6、TNF-a表達(dá)的變化。 抑制miR-10b能否減弱了對(duì)細(xì)菌感染清除能力?我們采用miR-10b antagomir尾靜脈注入到小鼠體內(nèi),48小時(shí)后,通過(guò)尾靜脈注入李斯特菌(2x104CFU/只),分別于24小時(shí)和48小時(shí)處死。每組小鼠取血,收集血清,采用ELISA檢測(cè)IL-6、TNF-α水平；而且分別收集肝臟和脾臟,勻漿,涂抹在LB瓊脂糖培養(yǎng)皿上,觀察細(xì)菌的菌落形成。 最后我們檢測(cè)抑制miR-10b能否減弱CD4+CD45RBhiT細(xì)胞誘導(dǎo)的腸炎。CD4+CD45RBhiT細(xì)胞誘導(dǎo)的腸炎類(lèi)似于人類(lèi)IBD炎癥。我們采用miR-10bantagomir尾靜脈注入到小鼠體內(nèi),每周兩次,連續(xù)注射3周；采用流式細(xì)胞分選CD4+CD45RBhiT細(xì)胞,5x105細(xì)胞/只腹腔注入到Rag-/-小鼠體內(nèi),每周注射兩次miR-10b antagomir。觀察小鼠體重及活動(dòng)。6周后處死小鼠,收取腸道組織制作石蠟病理切片,收取血液,離心收集血清,采用ELISA檢測(cè)炎癥因子。觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠體重變化情況,腸道炎癥狀況,免疫組化觀察腸道炎性細(xì)胞侵入情況,流式細(xì)胞分析T輔助細(xì)胞TH1和TH17細(xì)胞分化。 我們采用生物信息學(xué)分析,通過(guò)構(gòu)建Klf43'UTR包含預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因,驗(yàn)證鼠源miR-10b與Klf4是否有結(jié)合位點(diǎn)。 結(jié)果 巨噬細(xì)胞極化受局部微環(huán)境等多種因素的影響,本文意在探討niR-10b對(duì)巨噬細(xì)胞M1/M2分型的影響及調(diào)節(jié)。在發(fā)生M1型巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中,miR-10b表達(dá)明顯升高,而在M2型極化過(guò)程,表達(dá)沒(méi)有明顯改變,這提示miR-10b在M1型巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中可能起到重要作用。隨著微環(huán)境或者外界刺激的改變,巨噬細(xì)胞的極性發(fā)生相應(yīng)變化,與各亞型相關(guān)的標(biāo)記分子也會(huì)發(fā)生表達(dá)改變,我們檢測(cè)在巨噬細(xì)胞發(fā)生極化改變時(shí),miR-10b的表達(dá)也隨之發(fā)生變化,miR-10b在M1型極化時(shí)表達(dá)最高,在M2型極化因子刺激后表達(dá)明顯下降,而重新采用M1型極化因子刺激后,miR-10b表達(dá)升高,這說(shuō)明了巨噬細(xì)胞的極化可能影響了miR-10b的表達(dá)。反之miR-10b的表達(dá)也會(huì)影響巨噬細(xì)胞的極化,抑制miR-10b的表達(dá)能明顯抑制M1型巨噬細(xì)胞特征性基因iNOS表達(dá)水平及M1巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生致炎因子,如IL-6、TNF-α,M2型巨噬細(xì)胞特征性基因Klf4和IL-4R表達(dá)增加,增加miR-10b表達(dá)則提高了iNOS表達(dá),Klf4和IL-4R表達(dá)下降,這說(shuō)明了改變miR-10b的表達(dá)水平可以改變巨噬細(xì)胞極化狀態(tài),miR-10b促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化,抑制miR-10b是的巨噬細(xì)胞M1型極化受阻。M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)TH1和TH17反應(yīng),M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)TH2反應(yīng)。抑制miR-10b降低了T-bet mRNA,RORyt mRNA表達(dá)水平同時(shí)也降低了IFN-γ和IL-17表達(dá)水平,這說(shuō)明了抑制miR-10b表達(dá)減弱了TH1和TH17細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。我們采用5%肉湯培養(yǎng)基沖洗小鼠腹腔,收集腹腔巨噬細(xì)胞,將收集的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor,培養(yǎng)后注入小鼠腹腔,對(duì)比小鼠生存率：miR-10b inhibitor組生存率明顯高于對(duì)照組,并且血清中IL-6、TNF-α表達(dá)也明顯低于對(duì)照組。這說(shuō)明了抑制miR-10b可以導(dǎo)致機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素敏感性下降,也說(shuō)明了抑制了巨噬細(xì)胞向M1型極化,結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了抑制niR-10b能明顯抑制M1型極化。巨噬細(xì)胞不同極化狀態(tài)細(xì)菌入侵的反應(yīng)不用,M1型巨噬細(xì)胞可以分泌iNOS等殺死細(xì)菌,而M2型巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌感染不敏感。我們采用miR-10b antagomir尾靜脈注入到小鼠體內(nèi),再通過(guò)尾靜脈注入李斯特菌(2x104CFU/只),收集血清、肝臟和脾臟,勻漿,涂抹在LB瓊脂糖培養(yǎng)皿上,觀察細(xì)菌的菌落形成。結(jié)果顯示在miR-10b antagomir組肝臟和脾臟菌落比對(duì)照組明顯增多,而且血清中IL-6和TNF-α表達(dá)也明顯下降這說(shuō)明了在體內(nèi)抑制miR-10b的表達(dá)后,導(dǎo)致了M1向M2極化,致使對(duì)細(xì)菌的感染不敏感,對(duì)細(xì)菌的清楚能力下降。體外實(shí)驗(yàn)證明了抑制miR-10b能減弱TH1和TH17細(xì)胞的反應(yīng),TH1和TH17細(xì)胞被認(rèn)為是人類(lèi)IBD發(fā)病機(jī)制中介導(dǎo)炎癥的重要細(xì)胞亞群,我們采用CD4+CD45RBhiT細(xì)胞誘導(dǎo)的腸炎模型模擬人類(lèi)IBD炎癥,觀察抑制miR-10b可以減弱T細(xì)胞所介導(dǎo)的腸炎,這是由于M1型極化而導(dǎo)致TH1和TH17細(xì)胞反應(yīng)減弱所致。通過(guò)小鼠骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞,采用GM-CSF(10ng/mL)誘導(dǎo)5天,轉(zhuǎn)染miR-10b mimic,更換為rIL-4/IL-13分別刺激4小時(shí)和24小時(shí),結(jié)果表明在M2型巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)下,升高miR-10b能從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制KLF4的表達(dá)。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因,結(jié)果證實(shí)了與人類(lèi)miR-10b和Klf4結(jié)合相似,鼠miR-10b也能與KLF4特異性結(jié)合,。 結(jié)論 本研究第一次報(bào)道了miR-10b在M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況,揭示了miR-10b表達(dá)水平不僅可以隨巨噬細(xì)胞極性改變而發(fā)生變化,反之通過(guò)改變miR-10b的表達(dá)可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化分型。抑制miR-10b明顯抑制M1型極化,并減弱了TH1和TH17細(xì)胞的反應(yīng)。同時(shí)抑制miR-10b可以導(dǎo)致機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素敏感性下降,對(duì)細(xì)菌清除能力下降,減弱T細(xì)胞所介導(dǎo)的腸炎。通過(guò)構(gòu)建小鼠Klf43'UTR包含miR-10b結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因載體及相應(yīng)的突變載體,小鼠niR-10b能與Klf4結(jié)合。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【圖文】：

博士學(xué)位論文 癥反應(yīng)，發(fā)揮宿主免疫功能，也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體正常組織的炎癥損傷；M2型巨噬細(xì)胞(選擇活化型)，炎癥反應(yīng)后期發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)和纖維變性，同時(shí)對(duì)腫瘤的發(fā)生起到一定的促進(jìn)作用[10]。除此之外還發(fā)現(xiàn)有固有激活的巨唾細(xì)胞通過(guò)阻斷Toll樣受體所激活，主要是同殺菌活性及促炎因子釋放有關(guān)[11]�；钚詼p弱的巨嚼細(xì)胞在IL-10，TGF-p,所激活，或者阻斷CD200或者CD172a受體，主要表現(xiàn)出抗炎作用以及抑制MHC class II的表達(dá)[12]。本文主要針對(duì)Ml及M2型巨唾細(xì)胞進(jìn)行研究。IPeripheral blood ！ Inflamed tissue i

由骨髓干細(xì)胞發(fā)育為單核母細(xì)胞，最終發(fā)展為巨唾細(xì)胞的這一過(guò)程中都發(fā)現(xiàn)了miRNA參與與調(diào)控(如圖3.)[36]。I MyetndHSC progenitor Monocyte Macrophage： ：！ Maintenance Lineage commitment Activation ‘ imiR-125o miR-17-5p milt-155 [| mH-146 { TOossical Ultemotive而<^-"6 mili-33S m/R-9mimb? miR-342 miR-ISSlet-7e? miR-loeo mffriZS miP'146miR-187TSgNOS fi圖3.概括miRNA調(diào)節(jié)巨哩細(xì)胞發(fā)育和活化。介紹了 miRNA為維持造血干細(xì)胞自我更新，促進(jìn)造血干細(xì)胞向單核細(xì)胞分化，激活巨哩細(xì)胞極化。MiR-125a,miR-126, miR-99b, let-7e均在骨髓干細(xì)胞上有所表達(dá)，對(duì)骨髓干細(xì)胞的發(fā)育，分化等發(fā)揮了調(diào)控作用。其中miR-125通過(guò)抑制Kruepel樣因子6

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2718736