【摘要】：目的:檢測RACK1基因在T細胞中特異性敲除對小鼠γδT細胞和NKT細胞胸腺內發(fā)育、外周比例和數(shù)量的影響;并分析對感染免疫、炎癥損傷的影響。方法:采用Cre-LoxP系統(tǒng)條件性敲除T細胞中的RACK1基因,得到RACK1在T細胞中特異缺失的小鼠(KO小鼠,同窩對照小鼠稱為WT小鼠)。觀察李斯特菌感染后,WT小鼠和KO小鼠死亡率及其肝脾的載菌量有何差別。使用流式細胞術檢測CD3、CD4、CD8、γδTCR、Vγ1、Vγ2等,檢測胞內因子IL-17的表達。構建嵌合體小鼠,將CD45.1~+CD45.2~+的WT小鼠骨髓單個核細胞與CD45.1~-CD45.2~+的KO小鼠骨髓單個核細胞以1:1的比例通過尾靜脈注射,打入清髓后的CD45.1小鼠體內,分析兩種來源的γδT細胞在完全相同環(huán)境下,是否仍呈現(xiàn)一些方面的差異。利用Con A誘導建立小鼠急性肝損傷模型,觀察在WT和KO小鼠中,其死亡率、肝臟HE染色以及血清轉氨酶表達水平的高低。利用流式細胞術檢測CD3、NK1.1、CD1d-tetramer等,以及檢測胞內因子TNF-α、IFN-γ的表達水平,分析WT小鼠和KO小鼠在這些方面有何差異。結果:1、KO小鼠在受到李斯特菌的感染后,死亡率以及肝脾的載菌量計數(shù)與WT小鼠相比均有不同程度的下降。而KO小鼠中γδT細胞的百分比和絕對數(shù)相比于WT小鼠都大幅度升高。進一步使γδT細胞的亞群Vγ1、Vγ2以及分泌的IL-17的絕對數(shù)顯著升高。2、嵌合體小鼠的數(shù)據(jù)證明,來自于KO小鼠的γδT細胞并沒有顯著升高。3、KO小鼠中CD3~+CD1d-tetramer~+iNKT發(fā)育障礙,Con A誘導小鼠急性肝損傷模型表明,KO小鼠的死亡率遠低于WT小鼠,且HE染色中證明了KO小鼠的肝損傷非常有限。而血清中AST和ALT的水平測定同樣證明了WT小鼠的肝臟損傷更為顯著。4、表面marker染色證明了KO與WT小鼠相比,Con A誘導后,肝臟中傳統(tǒng)T細胞的百分比和絕對數(shù)量都大幅度減少,而CD3~+NK1.1~+NKT細胞和CD3~-NK1.1~+NK細胞的百分比和絕對數(shù)沒有變化;胞內因子染色證明了IFN-γ在T細胞、NKT細胞以及NK細胞中的比例和絕對數(shù)也都明顯下降,TNF-α卻沒有顯著變化。5、通過純化小鼠脾臟傳統(tǒng)T細胞,利用Con A在體外刺激后,發(fā)現(xiàn)IFN-γ的表達并沒有缺陷。結論:在小鼠模型中,證明了雖然KO小鼠外周傳統(tǒng)T細胞中的CD8~+T細胞比例和絕對數(shù)大幅度減少,但是小鼠清除細菌的能力并沒有由此而減弱,甚至更強。RACK1基因的敲除對外周γδT細胞的百分比和絕對值存在影響。構建嵌合體證明了在KO小鼠中,外周γδT細胞的增加是由于環(huán)境外在缺陷所導致的。而RACK1在T細胞中的特異性缺失,不僅使外周傳統(tǒng)T細胞中的百分比和絕對數(shù)出現(xiàn)了大幅度的減少,而且導致CD3~+CD1d-tetramer~+iNKT細胞發(fā)育障礙。Con A誘導后,RACK1在T細胞中的特異性缺失對肝臟起到了一定的保護作用。在特異性缺失RACK1的傳統(tǒng)T細胞中,Con A注射后IFN-γ的表達減少,可能是由于肝臟內部的微環(huán)境改變所致。在體外刺激外周傳統(tǒng)T細胞,RACK1并不直接影響IFN-γ的表達。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

題組早期構建。表達的重組酶能夠介導 LoxP 序列的因的條件性敲除。re 是在 T 細胞中條件性敲除基因的常用 cre，它在 T高達 90%，是研究基因與 T 細胞發(fā)育關系的理想 我們能夠看到是否具有兩個 LoxP 序列，以及 Cre 酶。以下的結果表明（如圖 1.1 所示），在基因水平上， 基因在 T 細胞中特異性敲除的小鼠。其中 F/F 表示基xP 序列，F(xiàn)/+表示雜合子，F(xiàn)/－表示基因兩端都沒有Cre+表示該小鼠具有 CD4-Cre酶，CD4-Cre-則表示沒有

特菌后的 7-10 天為 CD8+T 細胞的反應峰值，因此特殊說明，均在李斯特菌感染 7-8 天檢測，所采用量為 5×105CFU/只，活化感染劑量為 1×105CFU/只。采用致死劑量的李斯特菌以尾靜脈注射的方式鼠 和 Gnb2l1F/F,CD4-Cre小 鼠 死 亡 率 的 情 況 。 前re小鼠 CD8+T 細胞的數(shù)量大幅度減少，CD8+T 細胞體內保護性免疫減弱，死亡率應該高于 Gnb2l1F/F小示），我們看到 Gnb2l1F/F小鼠從第 3 天開始死亡，到了 60%。而 Gnb2l1F/F,CD4-Cre小鼠的死亡率不過只致了 Gnb2l1F/F,CD4-Cre小鼠在 CD8+T 細胞的數(shù)量大幅卻低于正常野生小鼠呢？

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