【摘要】：第一部分納米細(xì)菌的分離、培養(yǎng)、形態(tài)觀(guān)察和相關(guān)蛋白表達(dá) 背景：自從Kajander等在牛血清中發(fā)現(xiàn)了納米細(xì)菌抗原以來(lái)，納米細(xì)菌一直作為結(jié)石和鈣化疾病的危險(xiǎn)因素。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌與結(jié)石、炎癥、動(dòng)脈硬化等很多疾病密切相關(guān)。有學(xué)者在人類(lèi)唾液、牙齒表面、牙菌斑、牙結(jié)石和牙髓石、腎結(jié)石、膽結(jié)石、膀胱結(jié)石、尿結(jié)石和前列腺結(jié)石、慢性前列腺炎、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中分離培養(yǎng)出納米細(xì)菌。而且從文獻(xiàn)報(bào)道可以得知，納米細(xì)菌并沒(méi)有組織特異性，分別從組織、血液、唾液、關(guān)節(jié)腔積液中分離培養(yǎng)出了納米細(xì)菌。然而胎盤(pán)鈣化（placental calcification，PC）是否與納米細(xì)菌相關(guān)，未見(jiàn)報(bào)道。胎盤(pán)鈣化好發(fā)于妊娠后期，是產(chǎn)科最常見(jiàn)的病理鈣化改變，嚴(yán)重的Ⅲ級(jí)鈣化會(huì)導(dǎo)致胎兒功能不全時(shí)，發(fā)生胎兒窘迫、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒畸形、吸入性肺炎、新生兒窒息等一系列妊娠并發(fā)癥，其機(jī)制不明確。而胎盤(pán)鈣化與納米細(xì)菌是否相關(guān)，未見(jiàn)報(bào)道，本文旨在研究納米細(xì)菌與胎盤(pán)鈣化的關(guān)系和作用機(jī)理。 目的：1.尋找納米細(xì)菌和胎盤(pán)鈣化相關(guān)的直接依據(jù)。2.各種組織中培養(yǎng)分離的納米細(xì)菌與胎盤(pán)鈣化組織中培養(yǎng)的納米細(xì)菌的形態(tài)學(xué)比較和陽(yáng)性率比較。3.探討納米細(xì)菌快速增殖的方法。4.探討鈣化相關(guān)蛋白OPN，BMP-2、凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Fas）和致炎因子（IL-6）與納米細(xì)菌和胎盤(pán)鈣化的關(guān)系。 方法：1.取新鮮鈣化的胎盤(pán)組織直接切片、染色，透射電鏡下觀(guān)察納米細(xì)菌，同一胎盤(pán)的正常組織為陰性對(duì)照。2.鈣化胎盤(pán)和同一孕婦的臍血的納米細(xì)菌分離培養(yǎng)的陽(yáng)性率比較和形態(tài)學(xué)比較。3.不同孕婦的鈣化胎盤(pán)和正常胎盤(pán)組織的納米細(xì)菌分離培養(yǎng)的陽(yáng)性率比較和形態(tài)學(xué)比較。4.從鈣化胎盤(pán)中培養(yǎng)的納米細(xì)菌與從膽結(jié)石中培養(yǎng)的納米細(xì)菌的形態(tài)學(xué)比較。5.采用不同的增殖方法進(jìn)行納米細(xì)菌培養(yǎng)，觀(guān)察其濁度值變化。6.分別采用WB和免疫組化方法測(cè)定了鈣化胎盤(pán)組（NB+）和非鈣化胎盤(pán)組（NB-）中OPN、BMP-2、Bax、Fas的表達(dá)。7.采用ELISA方法測(cè)定了鈣化胎盤(pán)和非鈣化胎盤(pán)靜脈血和臍血中的IL-6濃度；8.采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定了兩組靜脈血和臍血中的ALP的濃度。 結(jié)果：1.采用直接切片在透射電鏡下從鈣化胎盤(pán)組織中找到形態(tài)與文獻(xiàn)報(bào)道的相似的納米細(xì)菌，為圓形或橢圓形納米顆粒，直徑約為50-500nm，每個(gè)顆粒都被具有不同電子密度的薄外殼包裹，有毛刺；而正常胎盤(pán)組織中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類(lèi)似納米顆粒。2.分離培養(yǎng)了20份鈣化的胎盤(pán)組織及其臍血中的納米細(xì)菌，為白色沉淀完全或部分粘附在試管底部，其陽(yáng)性率分別為65%和80%，二者沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05），二者的形態(tài)相似。3.分離20份正常胎盤(pán)組織中和其臍血中的納米細(xì)菌，其陽(yáng)性率分別為10%和20%，與鈣化組比較，顯著低于鈣化組（P0.01）,但形態(tài)沒(méi)有差別。4.分離培養(yǎng)了20例膽結(jié)石中的納米細(xì)菌，同樣為白色沉淀，其致密度強(qiáng)于胎盤(pán)組織分離培養(yǎng)的納米細(xì)菌，陽(yáng)性率為90%，高于鈣化胎盤(pán)組織，其透射電鏡下形態(tài)與鈣化胎盤(pán)組織中的納米細(xì)菌相似。5.分瓶傳代的方法，納米細(xì)菌增殖的速度高于直接換液的方法，平均6-10天，濁度值增加1倍。6.鈣化組中的OPN、BMP-2、Bax、Fas、和ALP都顯著高于非鈣化組（p0.01）。 結(jié)論：納米細(xì)菌與胎盤(pán)鈣化具有明顯的相關(guān)性，且其形態(tài)與文獻(xiàn)報(bào)道一致。另外納米細(xì)菌的感染沒(méi)有組織特異性，從胎盤(pán)組織、臍血和結(jié)石中培養(yǎng)出來(lái)的納米細(xì)菌形態(tài)相似；臍血中培養(yǎng)的納米細(xì)菌和鈣化胎盤(pán)組織中培養(yǎng)的納米細(xì)菌可能具有同源性。分瓶傳代有助于納米細(xì)菌的增殖。納米細(xì)菌、細(xì)胞凋亡、致炎因子和ALP都可能參與胎盤(pán)鈣化的形成，納米細(xì)菌可能是其中一個(gè)誘導(dǎo)因素。 第二部分納米細(xì)菌和羥基磷灰石對(duì)各種細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及其機(jī)理的初步探討 背景：前面已從組織層面證明了納米細(xì)菌和鈣化胎盤(pán)組織相關(guān)，而且可使鈣化胎盤(pán)的凋亡相關(guān)蛋白和致炎因子上調(diào)。有文獻(xiàn)報(bào)道納米細(xì)菌可抑制成纖維細(xì)胞的增殖。納米羥基磷灰石可致腫瘤細(xì)胞凋亡，與正常的成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞卻具有很好的相容性。那么納米細(xì)菌可否使正常的成骨細(xì)胞和相關(guān)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞毒作用呢？通過(guò)比較納米細(xì)菌和納米羥基磷灰石對(duì)生長(zhǎng)良好的成骨細(xì)胞C3H10、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和絨癌JAR細(xì)胞的細(xì)胞毒作用來(lái)從細(xì)胞層面探討納米細(xì)菌的致毒和致炎作用及其機(jī)理。 目的：比較納米細(xì)菌和納米羥基磷灰石對(duì)各種細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，進(jìn)一步闡明引起這些細(xì)胞毒作用的機(jī)理及其與鈣化相關(guān)蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的關(guān)系。 方法：分別用納米細(xì)菌和納米羥基磷灰石作用生長(zhǎng)良好的成骨細(xì)胞C3H10、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和絨癌JAR細(xì)胞。然后通過(guò)CCK8測(cè)定其細(xì)胞增殖抑制率；用hoechest22358熒光染色、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡率；采用倒置顯微鏡和電子顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)的改變；用Westernblot測(cè)定三種細(xì)胞中OPN、BMP-2、Bax、Fas蛋白表達(dá)。結(jié)果：倒置顯微鏡下觀(guān)察，培養(yǎng)48h后乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)吞噬了NB和HA，與對(duì)照組比較，細(xì)胞漿中出現(xiàn)大量的空泡，NB細(xì)菌的作用強(qiáng)于HA組。成骨細(xì)胞C3H10和絨癌JAR細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)變化不明顯。CCK8結(jié)果表明：培養(yǎng)48h后NB和HA均能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和絨癌JAR細(xì)胞增殖，NB作用強(qiáng)于HA，且具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。而對(duì)于成骨細(xì)胞C3H10，HA無(wú)細(xì)胞增殖抑制作用。Hoechest22358熒光染色、流式細(xì)胞儀測(cè)定顯示，對(duì)于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和絨癌JAR細(xì)胞，NB和HA主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞毒作用，且NB作用強(qiáng)于HA。而對(duì)于成骨細(xì)胞C3H10HA無(wú)細(xì)胞毒作用。Westernblot測(cè)定發(fā)現(xiàn)，對(duì)于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和絨癌JAR細(xì)胞，OPN、BMP-2、Bax、Fas的表達(dá)，NB和HA均高于對(duì)照組，NB作用強(qiáng)于HA。而對(duì)于成骨細(xì)胞C3H10，HA組與對(duì)照組比較，鈣化相關(guān)蛋白BMP-2高于對(duì)照組，凋亡相關(guān)蛋白Bax無(wú)明顯變化；NB的BMP-2和Bax均高于對(duì)照組。透射電鏡結(jié)果顯示，NB可引起細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)凋亡小體，線(xiàn)粒體腫脹，核固縮等細(xì)胞凋亡的特征；在JAR細(xì)胞中還可見(jiàn)細(xì)胞溶解和大量自噬體出現(xiàn)，而HA組和對(duì)照組沒(méi)有明顯的變化。 結(jié)論：與對(duì)照組比較，納米細(xì)菌和羥基磷灰石均能引起腫瘤細(xì)胞毒作用，無(wú)論是C3H10細(xì)胞還MDA-MB-231細(xì)胞及JAR細(xì)胞，納米細(xì)菌的細(xì)胞毒作用均強(qiáng)于羥基磷灰石，主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮細(xì)胞毒作用。OPN、BMP-2、Bax、Fas的表達(dá)均強(qiáng)于HA，說(shuō)明NB可促進(jìn)OPN、BMP-2的表達(dá)，與鈣化相關(guān)，而B(niǎo)ax、Fas升高預(yù)示NB可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，主要通過(guò)Fas和FasL的途徑來(lái)發(fā)揮細(xì)胞毒作用。 第三部分納米細(xì)菌和羥基磷灰石致SD大鼠胎盤(pán)鈣化的初步探討 背景：第一部分從組織層面證明了納米細(xì)菌與胎盤(pán)鈣化組織細(xì)胞凋亡相關(guān)；第二部分又從細(xì)胞層面對(duì)比了納米細(xì)菌和納米羥基磷灰石對(duì)人絨癌JAR細(xì)胞，人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和人成骨細(xì)胞C3H10的細(xì)胞毒作用。NB不僅僅引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，還可引起腫瘤細(xì)胞的死亡和正常人成骨細(xì)胞的凋亡和死亡，而HA僅僅只引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，說(shuō)明NB對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用不僅僅是因?yàn)榱u基磷灰石的作用，還與其分泌相關(guān)蛋白和增殖分裂相關(guān)。另外，納米細(xì)菌和納米羥基磷灰石均能上調(diào)鈣化相關(guān)蛋白OPN和BMP-2。那么納米細(xì)菌和納米羥基磷灰石能不能直接引起胎盤(pán)鈣化，我們擬通過(guò)SD大鼠造模來(lái)進(jìn)行研究。 目的：探討納米細(xì)菌是否可直接導(dǎo)致SD大鼠胎盤(pán)鈣化，比較納米細(xì)菌和羥基磷灰石對(duì)SD大鼠胎盤(pán)作用的差異。方法：取28只SD大鼠，7只雄，21只雌，按雌雄3:1合攏，在受孕10天，分PBS、HA、NB三組于宮角處注入200μl藥物，于第14天加強(qiáng)一次，于受孕21天取出胎盤(pán)進(jìn)行肉眼觀(guān)察，電鏡切片、組化染色、Westernblot測(cè)定及納米細(xì)菌培養(yǎng)。 結(jié)果：三組SD大鼠胎盤(pán)組織比較，肉眼未見(jiàn)明顯鈣化；納米細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性；透射電鏡下觀(guān)察組織切片，未見(jiàn)納米顆粒和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；凋亡相關(guān)蛋白（Bax）和鈣化相關(guān)蛋白（BMP-2）的表達(dá)無(wú)明顯差異。 結(jié)論：PBS、HA、NB三組SD大鼠的胎盤(pán)無(wú)明顯鈣化，形態(tài)結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)也無(wú)明顯差異，一方面說(shuō)明HA和NB作用大鼠胎盤(pán)時(shí)間較短，未形成鈣化；另一方面說(shuō)明NB只是引起細(xì)胞凋亡或死亡一個(gè)原因，與鈣化相關(guān)，并不是引起胎盤(pán)鈣化的直接原因。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R378.99
【圖文】：

28圖 1.1.1 不同組織及其分離培養(yǎng)物中的納米細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀(guān)察Fig.1.1.1.The morphology of NB under TEM and SEM in freshly-fixed calcified platissues and in different nutrient solution.a-c:新鮮鈣化胎盤(pán)組織直接切片中的納米細(xì)菌，透射電鏡下為圓形或橢圓形直徑 50-500nm，外圍有毛刺，d 為鈣化胎盤(pán)組織中培養(yǎng)出來(lái)的納米細(xì)菌，中培養(yǎng)出的納米細(xì)菌，f 為鈣化胎盤(pán)培養(yǎng)出的掃描電鏡下的納米細(xì)菌，g、h透射電鏡下的納米細(xì)菌，i 為鈣化胎盤(pán)中培養(yǎng)出的納米細(xì)菌的分裂相，j 為養(yǎng)出的納米細(xì)菌。a-c: The nanobacteria of fresh calcification placenta tissue, they are round or ovaunder the TEM, 50-500 nm in diameter, periphery have burrs. d:the nanobacter

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文from calcification of placenta tissue under TEM; e:the nanobacteria isolaumbilical cord blood under TEM; f:the nanobacteria isolated from calcification oftissue under SEM; g, h: the nanobacteria isolated from gallstones underTEnanobacteria split phase isolated from calcification of placenta tissue; j:the nanisolated from umbilical cord blood.

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2716443