【摘要】：第一部分納米細菌的分離、培養(yǎng)、形態(tài)觀察和相關(guān)蛋白表達 背景：自從Kajander等在牛血清中發(fā)現(xiàn)了納米細菌抗原以來，納米細菌一直作為結(jié)石和鈣化疾病的危險因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)納米細菌與結(jié)石、炎癥、動脈硬化等很多疾病密切相關(guān)。有學者在人類唾液、牙齒表面、牙菌斑、牙結(jié)石和牙髓石、腎結(jié)石、膽結(jié)石、膀胱結(jié)石、尿結(jié)石和前列腺結(jié)石、慢性前列腺炎、動脈粥樣硬化斑塊中分離培養(yǎng)出納米細菌。而且從文獻報道可以得知，納米細菌并沒有組織特異性，分別從組織、血液、唾液、關(guān)節(jié)腔積液中分離培養(yǎng)出了納米細菌。然而胎盤鈣化（placental calcification，PC）是否與納米細菌相關(guān)，未見報道。胎盤鈣化好發(fā)于妊娠后期，是產(chǎn)科最常見的病理鈣化改變，嚴重的Ⅲ級鈣化會導致胎兒功能不全時，發(fā)生胎兒窘迫、胎兒生長受限、胎兒畸形、吸入性肺炎、新生兒窒息等一系列妊娠并發(fā)癥，其機制不明確。而胎盤鈣化與納米細菌是否相關(guān)，未見報道，本文旨在研究納米細菌與胎盤鈣化的關(guān)系和作用機理。 目的：1.尋找納米細菌和胎盤鈣化相關(guān)的直接依據(jù)。2.各種組織中培養(yǎng)分離的納米細菌與胎盤鈣化組織中培養(yǎng)的納米細菌的形態(tài)學比較和陽性率比較。3.探討納米細菌快速增殖的方法。4.探討鈣化相關(guān)蛋白OPN，BMP-2、凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Fas）和致炎因子（IL-6）與納米細菌和胎盤鈣化的關(guān)系。 方法：1.取新鮮鈣化的胎盤組織直接切片、染色，透射電鏡下觀察納米細菌，同一胎盤的正常組織為陰性對照。2.鈣化胎盤和同一孕婦的臍血的納米細菌分離培養(yǎng)的陽性率比較和形態(tài)學比較。3.不同孕婦的鈣化胎盤和正常胎盤組織的納米細菌分離培養(yǎng)的陽性率比較和形態(tài)學比較。4.從鈣化胎盤中培養(yǎng)的納米細菌與從膽結(jié)石中培養(yǎng)的納米細菌的形態(tài)學比較。5.采用不同的增殖方法進行納米細菌培養(yǎng)，觀察其濁度值變化。6.分別采用WB和免疫組化方法測定了鈣化胎盤組（NB+）和非鈣化胎盤組（NB-）中OPN、BMP-2、Bax、Fas的表達。7.采用ELISA方法測定了鈣化胎盤和非鈣化胎盤靜脈血和臍血中的IL-6濃度；8.采用全自動生化分析儀測定了兩組靜脈血和臍血中的ALP的濃度。 結(jié)果：1.采用直接切片在透射電鏡下從鈣化胎盤組織中找到形態(tài)與文獻報道的相似的納米細菌，為圓形或橢圓形納米顆粒，直徑約為50-500nm，每個顆粒都被具有不同電子密度的薄外殼包裹，有毛刺；而正常胎盤組織中沒有發(fā)現(xiàn)類似納米顆粒。2.分離培養(yǎng)了20份鈣化的胎盤組織及其臍血中的納米細菌，為白色沉淀完全或部分粘附在試管底部，其陽性率分別為65%和80%，二者沒有統(tǒng)計學差異（p0.05），二者的形態(tài)相似。3.分離20份正常胎盤組織中和其臍血中的納米細菌，其陽性率分別為10%和20%，與鈣化組比較，顯著低于鈣化組（P0.01）,但形態(tài)沒有差別。4.分離培養(yǎng)了20例膽結(jié)石中的納米細菌，同樣為白色沉淀，其致密度強于胎盤組織分離培養(yǎng)的納米細菌，陽性率為90%，高于鈣化胎盤組織，其透射電鏡下形態(tài)與鈣化胎盤組織中的納米細菌相似。5.分瓶傳代的方法，納米細菌增殖的速度高于直接換液的方法，平均6-10天，濁度值增加1倍。6.鈣化組中的OPN、BMP-2、Bax、Fas、和ALP都顯著高于非鈣化組（p0.01）。 結(jié)論：納米細菌與胎盤鈣化具有明顯的相關(guān)性，且其形態(tài)與文獻報道一致。另外納米細菌的感染沒有組織特異性，從胎盤組織、臍血和結(jié)石中培養(yǎng)出來的納米細菌形態(tài)相似；臍血中培養(yǎng)的納米細菌和鈣化胎盤組織中培養(yǎng)的納米細菌可能具有同源性。分瓶傳代有助于納米細菌的增殖。納米細菌、細胞凋亡、致炎因子和ALP都可能參與胎盤鈣化的形成，納米細菌可能是其中一個誘導因素。 第二部分納米細菌和羥基磷灰石對各種細胞的細胞毒作用及其機理的初步探討 背景：前面已從組織層面證明了納米細菌和鈣化胎盤組織相關(guān)，而且可使鈣化胎盤的凋亡相關(guān)蛋白和致炎因子上調(diào)。有文獻報道納米細菌可抑制成纖維細胞的增殖。納米羥基磷灰石可致腫瘤細胞凋亡，與正常的成纖維細胞和成骨細胞卻具有很好的相容性。那么納米細菌可否使正常的成骨細胞和相關(guān)的腫瘤細胞發(fā)生細胞毒作用呢？通過比較納米細菌和納米羥基磷灰石對生長良好的成骨細胞C3H10、乳腺癌MDA-MB-231細胞和絨癌JAR細胞的細胞毒作用來從細胞層面探討納米細菌的致毒和致炎作用及其機理。 目的：比較納米細菌和納米羥基磷灰石對各種細胞的細胞毒作用，進一步闡明引起這些細胞毒作用的機理及其與鈣化相關(guān)蛋白、細胞凋亡相關(guān)蛋白的關(guān)系。 方法：分別用納米細菌和納米羥基磷灰石作用生長良好的成骨細胞C3H10、乳腺癌MDA-MB-231細胞和絨癌JAR細胞。然后通過CCK8測定其細胞增殖抑制率；用hoechest22358熒光染色、流式細胞儀測定細胞的凋亡率；采用倒置顯微鏡和電子顯微鏡觀察細胞的形態(tài)的改變；用Westernblot測定三種細胞中OPN、BMP-2、Bax、Fas蛋白表達。結(jié)果：倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)48h后乳腺癌MDA-MB-231細胞胞漿中可見吞噬了NB和HA，與對照組比較，細胞漿中出現(xiàn)大量的空泡，NB細菌的作用強于HA組。成骨細胞C3H10和絨癌JAR細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)變化不明顯。CCK8結(jié)果表明：培養(yǎng)48h后NB和HA均能抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞和絨癌JAR細胞增殖，NB作用強于HA，且具有時間和濃度依賴性。而對于成骨細胞C3H10，HA無細胞增殖抑制作用。Hoechest22358熒光染色、流式細胞儀測定顯示，對于乳腺癌MDA-MB-231細胞和絨癌JAR細胞，NB和HA主要通過促進細胞凋亡發(fā)揮細胞毒作用，且NB作用強于HA。而對于成骨細胞C3H10HA無細胞毒作用。Westernblot測定發(fā)現(xiàn)，對于乳腺癌MDA-MB-231細胞和絨癌JAR細胞，OPN、BMP-2、Bax、Fas的表達，NB和HA均高于對照組，NB作用強于HA。而對于成骨細胞C3H10，HA組與對照組比較，鈣化相關(guān)蛋白BMP-2高于對照組，凋亡相關(guān)蛋白Bax無明顯變化；NB的BMP-2和Bax均高于對照組。透射電鏡結(jié)果顯示，NB可引起細胞凋亡，出現(xiàn)凋亡小體，線粒體腫脹，核固縮等細胞凋亡的特征；在JAR細胞中還可見細胞溶解和大量自噬體出現(xiàn)，而HA組和對照組沒有明顯的變化。 結(jié)論：與對照組比較，納米細菌和羥基磷灰石均能引起腫瘤細胞毒作用，無論是C3H10細胞還MDA-MB-231細胞及JAR細胞，納米細菌的細胞毒作用均強于羥基磷灰石，主要通過促進細胞凋亡來發(fā)揮細胞毒作用。OPN、BMP-2、Bax、Fas的表達均強于HA，說明NB可促進OPN、BMP-2的表達，與鈣化相關(guān)，而Bax、Fas升高預(yù)示NB可促進細胞凋亡，主要通過Fas和FasL的途徑來發(fā)揮細胞毒作用。 第三部分納米細菌和羥基磷灰石致SD大鼠胎盤鈣化的初步探討 背景：第一部分從組織層面證明了納米細菌與胎盤鈣化組織細胞凋亡相關(guān)；第二部分又從細胞層面對比了納米細菌和納米羥基磷灰石對人絨癌JAR細胞，人乳腺癌MDA-MB-231細胞和人成骨細胞C3H10的細胞毒作用。NB不僅僅引起腫瘤細胞的凋亡，還可引起腫瘤細胞的死亡和正常人成骨細胞的凋亡和死亡，而HA僅僅只引起腫瘤細胞的凋亡，說明NB對細胞的細胞毒作用不僅僅是因為羥基磷灰石的作用，還與其分泌相關(guān)蛋白和增殖分裂相關(guān)。另外，納米細菌和納米羥基磷灰石均能上調(diào)鈣化相關(guān)蛋白OPN和BMP-2。那么納米細菌和納米羥基磷灰石能不能直接引起胎盤鈣化，我們擬通過SD大鼠造模來進行研究。 目的：探討納米細菌是否可直接導致SD大鼠胎盤鈣化，比較納米細菌和羥基磷灰石對SD大鼠胎盤作用的差異。方法：取28只SD大鼠，7只雄，21只雌，按雌雄3:1合攏，在受孕10天，分PBS、HA、NB三組于宮角處注入200μl藥物，于第14天加強一次，于受孕21天取出胎盤進行肉眼觀察，電鏡切片、組化染色、Westernblot測定及納米細菌培養(yǎng)。 結(jié)果：三組SD大鼠胎盤組織比較，肉眼未見明顯鈣化；納米細菌培養(yǎng)均為陰性；透射電鏡下觀察組織切片，未見納米顆粒和細胞形態(tài)學的改變；凋亡相關(guān)蛋白（Bax）和鈣化相關(guān)蛋白（BMP-2）的表達無明顯差異。 結(jié)論：PBS、HA、NB三組SD大鼠的胎盤無明顯鈣化，形態(tài)結(jié)構(gòu)和蛋白表達也無明顯差異，一方面說明HA和NB作用大鼠胎盤時間較短，未形成鈣化；另一方面說明NB只是引起細胞凋亡或死亡一個原因，與鈣化相關(guān)，并不是引起胎盤鈣化的直接原因。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378.99
【圖文】：

28圖 1.1.1 不同組織及其分離培養(yǎng)物中的納米細菌的形態(tài)學觀察Fig.1.1.1.The morphology of NB under TEM and SEM in freshly-fixed calcified platissues and in different nutrient solution.a-c:新鮮鈣化胎盤組織直接切片中的納米細菌，透射電鏡下為圓形或橢圓形直徑 50-500nm，外圍有毛刺，d 為鈣化胎盤組織中培養(yǎng)出來的納米細菌，中培養(yǎng)出的納米細菌，f 為鈣化胎盤培養(yǎng)出的掃描電鏡下的納米細菌，g、h透射電鏡下的納米細菌，i 為鈣化胎盤中培養(yǎng)出的納米細菌的分裂相，j 為養(yǎng)出的納米細菌。a-c: The nanobacteria of fresh calcification placenta tissue, they are round or ovaunder the TEM, 50-500 nm in diameter, periphery have burrs. d:the nanobacter

重慶醫(yī)科大學博士研究生學位論文from calcification of placenta tissue under TEM; e:the nanobacteria isolaumbilical cord blood under TEM; f:the nanobacteria isolated from calcification oftissue under SEM; g, h: the nanobacteria isolated from gallstones underTEnanobacteria split phase isolated from calcification of placenta tissue; j:the nanisolated from umbilical cord blood.

【參考文獻】

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本文編號：2716443