【摘要】：藥物性肝損傷,已經(jīng)成為中國急性肝衰竭發(fā)生的主要原因之一。醋氨酚(Acetaminophen,APAP),又稱對乙酰氨基酚,是一種最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物,常被用于感冒藥中。過量服用醋氨酚造成的肝病在藥物性肝病中占據(jù)最大比例。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A1(GSTA1)是一種藥物代謝Ⅱ相酶,能催化醋氨酚的有毒代謝產(chǎn)物N-乙酰對苯亞胺醌(NAPQI)與谷胱甘肽(GSH)的結(jié)合,提高細胞對抗氧化應(yīng)激和抵抗外來毒物的能力。c-Jun氨基末端激酶(JNKs)屬于絲裂原活化蛋白激酶家族,JNK信號通路可被多種刺激激活,在細胞因子、UV照射、熱休克等外界刺激作用下,其上游蛋白MKK4和MKK7使JNK上Thr183、Tyr185磷酸化,JNK入核并激活下游底物c-jun,進而影響細胞凋亡或分化。本課題以HepG2細胞為對象,建立醋氨酚誘導的不同程度的藥物性肝細胞損傷模型,研究醋氨酚誘導的肝細胞損傷中JNK信號通路與GSTA1的作用與關(guān)系,為進一步認識藥物性肝損傷的損傷機制及保護機制奠定理論基礎(chǔ)。本試驗采用不同濃度的醋氨酚處理HepG2細胞,通過檢測培養(yǎng)上清液中轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性來判斷肝細胞損傷程度,確定出可以造成不同程度肝細胞損傷的作用濃度,復(fù)制藥物性肝細胞損傷體外模型。在該模型的基礎(chǔ)上通過檢測轉(zhuǎn)氨酶活性篩選JNK抑制劑SP600125(SP)的最適作用濃度。隨后研究醋氨酚誘導的肝細胞損傷中JNK信號通路相關(guān)蛋白的變化與JNK信號通路對GSTA1的影響。細胞隨機分為六組:對照組、不同濃度的APAP組(6 Mm、8 mM)、6 mM APAP+SP組(6 mM APAP+2μM SP600125)、8 mM APAP+SP600125組(8 mM APAP+2μM SP600125),抑制劑對照組(2μM SP600125)。應(yīng)用試劑盒檢測培養(yǎng)上清中轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性和肝細胞生化指標水平;采用Western blot方法測定肝組織中JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun、c-fos、p-c-fos、ASK1、p-ASK1、MKK4、p-MKK4和GSTA1的蛋白相對表達量;采用Hoechst 33342染色法檢測細胞凋亡。通過以上研究,明確在APAP誘導的藥物性肝細胞損傷中JNK信號通路是否被激活,探討其與GSTA1表達之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明:1、應(yīng)用梯度濃度APAP作用HepG2細胞6 h可對肝細胞造成不同程度的損傷。當作用濃度為6 mM時,上清液中ALT和AST活性均顯著升高(p0.05);當作用濃度為8 mM時,ALT和AST活性均極顯著升高(p0.01)。最終確定以6 mM和8 mM為APAP作用濃度,復(fù)制不同程度肝細胞損傷的模型。2、在肝細胞損傷模型的基礎(chǔ)上,篩選出JNK抑制劑SP600125的最適作用濃度為2μM。3、SP600125作用于肝細胞損傷模型后,與8 mM APAP組相比,8 mM APAP+2μM SP600125組ALT和AST活性均極顯著下降(p0.01),肝細胞指標均極顯著變化(p0.01);與6 mM APAP組相比,6 mM APAP+2μM SP600125組ALT、AST活性顯著下降(p0.05),肝細胞指標均顯著變化(p0.05),表明SP600125能減輕APAP造成的氧化損傷。4、JNK信號通路上下游蛋白的表達結(jié)果表明,與對照組比較,不同濃度APAP組中p-JNK/JNK、p-c-jun/c-jun比值均升高(p0.01);6 mM APAP+2μM SP600125組p-JNK/JNK、p-c-jun/c-jun比值顯著低于6 mM APAP組(p0.05);8 mM APAP+2μM SP600125組p-JNK/JNK、p-c-jun/c-jun比值極顯著低于8 mM APAP組(p0.01)。不同劑量APAP組中p-c-fos/c-fos比值均高于對照組(p0.05);抑制JNK的活化不會降低p-c-fos/c-fos比值,c-fos可能有其他通路激活參與藥物性肝細胞損傷過程。以上結(jié)果說明JNK信號通路在APAP誘導的不同程度的藥物性肝細胞損傷中均被激活;抑制JNK的活化能使APAP誘導損傷的肝細胞中JNK、c-jun磷酸化水平下降(p0.01),但c-fos磷酸化水平?jīng)]有變化,SP600125能顯著抑制轉(zhuǎn)錄因子c-jun的活化,而JNK上游蛋白ASK1和MKK4磷酸化水平不因JNK磷酸化被抑制而發(fā)生明顯變化,表明APAP誘導的藥物性肝細胞損傷中由c-jun介導的細胞凋亡被SP600125抑制,而其他細胞信號通路介導的凋亡未發(fā)生顯著性變化。5、GSTA1蛋白表達結(jié)果顯示,6 mM和8 mM APAP組中GSTA1相對表達量均極顯著低于對照組(p0.01);6 mM APAP+2μM SP600125組GSTA1相對表達量顯著高于6 mM APAP組(p0.01);8 mM APAP+2μM SP600125組GSTA1相對表達量極顯著高于6 mM APAP組(p0.01)。APAP誘導的肝損傷中GSTA1表達量減少,JNK被SP600125抑制后肝細胞中GSTA1表達量升高,說明JNK信號通路的激活可以減少肝細胞內(nèi)GSTA1的蛋白表達。6、Hoechst 33342檢測凋亡結(jié)果表明,隨著APAP濃度的升高,細胞發(fā)生凋亡的趨勢越明顯,細胞核濃染成明亮藍色熒光,出現(xiàn)明顯的核固縮;JNK激活被SP600125抑制的肝細胞中,細胞凋亡現(xiàn)象明顯減少,未見大量核濃染或核碎裂現(xiàn)象。說明在APAP誘導的藥物性肝細胞損傷中,HepG2細胞凋亡增加,而抑制JNK活化通路能減少由APAP引起的HepG2細胞的凋亡,表明在APAP誘導的肝細胞損傷中JNK信號通路激活能夠顯著增加肝細胞的凋亡。本研究成功復(fù)制APAP誘導的肝細胞損傷模型,并確定JNK抑制劑SP600125的最適作用濃度。在APAP誘導的肝細胞損傷中,JNK抑制劑SP600125處理APAP誘導的藥物性肝細胞損傷模型,肝細胞損傷和氧化應(yīng)激被減輕。JNK被SP600125抑制時,下游底物c-jun的磷酸化減少,肝細胞中GSTA1的表達量提高。確定JNK信號通路在APAP誘導的肝細胞損傷中被激活,JNK信號通路參與調(diào)控藥物性肝細胞損傷中GSTA1的表達,但其機制仍需進一步深入研究。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R965;R-332
【圖文】：

分析導肝細胞損傷模型的復(fù)制 HepG2 細胞藥物性損傷模型復(fù)制的試驗中，不同濃度的ALT 和 AST 活性變化如圖 3-1 和圖 3-2。結(jié)果顯示，與對理后，培養(yǎng)上清中 ALT 和 AST 活性均顯著升高（p<0.05AST 活性均極顯著升高（p<0.01）。在 APAP 濃度分別為 和 AST 活力升高程度不同。因此，選擇 APAP 濃度為 6 m細胞損傷模型。

ALT 和 AST 活性變化如圖 3-1 和圖 3-2。結(jié)果顯示，與對理后，培養(yǎng)上清中 ALT 和 AST 活性均顯著升高（p<0.05AST 活性均極顯著升高（p<0.01）。在 APAP 濃度分別為 和 AST 活力升高程度不同。因此，選擇 APAP 濃度為 6 m細胞損傷模型。比 p<0.05；**表示與對照組相比 p<0.01 不同濃度 APAP 對細胞培養(yǎng)上清 ALT 活性的影響（ x ±s 3-1 The changes of ALT activity in culture supernatant ( x ±s

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 覃芳;張智博;;JNK信號通路與自噬的研究進展[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2015年09期

2 董亮;何永志;王遠亮;董志揚;;超氧化物歧化酶(SOD)的應(yīng)用研究進展[J];中國農(nóng)業(yè)科技導報;2013年05期

3 王世強;婁淑杰;;常氧和低氧條件下介導大鼠神經(jīng)干細胞分化的信號通路分析[J];神經(jīng)解剖學雜志;2013年02期

4 侯炳旭;馮麗英;;JNK信號通路介導的凋亡在疾病中的作用[J];世界華人消化雜志;2011年17期

5 楊帆 ,李淑梅;醋氨酚的毒性[J];國外醫(yī)學.護理學分冊;2005年10期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 賴小希;白蛋白誘導的腎小管細胞凋亡與MAPK信號通路[D];武漢大學;2004年

相關(guān)碩士學位論文 前5條

1 常軼聰;醋氨酚誘導藥物性肝細胞損傷中HNF-1調(diào)節(jié)GSTA1表達分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2017年

2 任東東;白介素-37抗對乙酰氨基酚誘導小鼠肝損傷的作用研究[D];四川醫(yī)科大學;2015年

3 周瓊;抑制JNK信號通路調(diào)控APP代謝及Aβ生成的作用及其機制[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

4 楊周萍;GSTA1在肺癌細胞中的表達及其功能研究[D];廣東藥學院;2015年

5 李柳紅;大鼠局灶腦缺血再灌注及GM1干預(yù)后ASK1和c-jun表達變化與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系[D];中南大學;2007年

本文編號：2716204