【摘要】：藥物性肝損傷,已經(jīng)成為中國(guó)急性肝衰竭發(fā)生的主要原因之一。醋氨酚(Acetaminophen,APAP),又稱(chēng)對(duì)乙酰氨基酚,是一種最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物,常被用于感冒藥中。過(guò)量服用醋氨酚造成的肝病在藥物性肝病中占據(jù)最大比例。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A1(GSTA1)是一種藥物代謝Ⅱ相酶,能催化醋氨酚的有毒代謝產(chǎn)物N-乙酰對(duì)苯亞胺醌(NAPQI)與谷胱甘肽(GSH)的結(jié)合,提高細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激和抵抗外來(lái)毒物的能力。c-Jun氨基末端激酶(JNKs)屬于絲裂原活化蛋白激酶家族,JNK信號(hào)通路可被多種刺激激活,在細(xì)胞因子、UV照射、熱休克等外界刺激作用下,其上游蛋白MKK4和MKK7使JNK上Thr183、Tyr185磷酸化,JNK入核并激活下游底物c-jun,進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡或分化。本課題以HepG2細(xì)胞為對(duì)象,建立醋氨酚誘導(dǎo)的不同程度的藥物性肝細(xì)胞損傷模型,研究醋氨酚誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中JNK信號(hào)通路與GSTA1的作用與關(guān)系,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)藥物性肝損傷的損傷機(jī)制及保護(hù)機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)采用不同濃度的醋氨酚處理HepG2細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性來(lái)判斷肝細(xì)胞損傷程度,確定出可以造成不同程度肝細(xì)胞損傷的作用濃度,復(fù)制藥物性肝細(xì)胞損傷體外模型。在該模型的基礎(chǔ)上通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶活性篩選JNK抑制劑SP600125(SP)的最適作用濃度。隨后研究醋氨酚誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中JNK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化與JNK信號(hào)通路對(duì)GSTA1的影響。細(xì)胞隨機(jī)分為六組:對(duì)照組、不同濃度的APAP組(6 Mm、8 mM)、6 mM APAP+SP組(6 mM APAP+2μM SP600125)、8 mM APAP+SP600125組(8 mM APAP+2μM SP600125),抑制劑對(duì)照組(2μM SP600125)。應(yīng)用試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性和肝細(xì)胞生化指標(biāo)水平;采用Western blot方法測(cè)定肝組織中JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun、c-fos、p-c-fos、ASK1、p-ASK1、MKK4、p-MKK4和GSTA1的蛋白相對(duì)表達(dá)量;采用Hoechst 33342染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。通過(guò)以上研究,明確在APAP誘導(dǎo)的藥物性肝細(xì)胞損傷中JNK信號(hào)通路是否被激活,探討其與GSTA1表達(dá)之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明:1、應(yīng)用梯度濃度APAP作用HepG2細(xì)胞6 h可對(duì)肝細(xì)胞造成不同程度的損傷。當(dāng)作用濃度為6 mM時(shí),上清液中ALT和AST活性均顯著升高(p0.05);當(dāng)作用濃度為8 mM時(shí),ALT和AST活性均極顯著升高(p0.01)。最終確定以6 mM和8 mM為APAP作用濃度,復(fù)制不同程度肝細(xì)胞損傷的模型。2、在肝細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)上,篩選出JNK抑制劑SP600125的最適作用濃度為2μM。3、SP600125作用于肝細(xì)胞損傷模型后,與8 mM APAP組相比,8 mM APAP+2μM SP600125組ALT和AST活性均極顯著下降(p0.01),肝細(xì)胞指標(biāo)均極顯著變化(p0.01);與6 mM APAP組相比,6 mM APAP+2μM SP600125組ALT、AST活性顯著下降(p0.05),肝細(xì)胞指標(biāo)均顯著變化(p0.05),表明SP600125能減輕APAP造成的氧化損傷。4、JNK信號(hào)通路上下游蛋白的表達(dá)結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,不同濃度APAP組中p-JNK/JNK、p-c-jun/c-jun比值均升高(p0.01);6 mM APAP+2μM SP600125組p-JNK/JNK、p-c-jun/c-jun比值顯著低于6 mM APAP組(p0.05);8 mM APAP+2μM SP600125組p-JNK/JNK、p-c-jun/c-jun比值極顯著低于8 mM APAP組(p0.01)。不同劑量APAP組中p-c-fos/c-fos比值均高于對(duì)照組(p0.05);抑制JNK的活化不會(huì)降低p-c-fos/c-fos比值,c-fos可能有其他通路激活參與藥物性肝細(xì)胞損傷過(guò)程。以上結(jié)果說(shuō)明JNK信號(hào)通路在APAP誘導(dǎo)的不同程度的藥物性肝細(xì)胞損傷中均被激活;抑制JNK的活化能使APAP誘導(dǎo)損傷的肝細(xì)胞中JNK、c-jun磷酸化水平下降(p0.01),但c-fos磷酸化水平?jīng)]有變化,SP600125能顯著抑制轉(zhuǎn)錄因子c-jun的活化,而JNK上游蛋白ASK1和MKK4磷酸化水平不因JNK磷酸化被抑制而發(fā)生明顯變化,表明APAP誘導(dǎo)的藥物性肝細(xì)胞損傷中由c-jun介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被SP600125抑制,而其他細(xì)胞信號(hào)通路介導(dǎo)的凋亡未發(fā)生顯著性變化。5、GSTA1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,6 mM和8 mM APAP組中GSTA1相對(duì)表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組(p0.01);6 mM APAP+2μM SP600125組GSTA1相對(duì)表達(dá)量顯著高于6 mM APAP組(p0.01);8 mM APAP+2μM SP600125組GSTA1相對(duì)表達(dá)量極顯著高于6 mM APAP組(p0.01)。APAP誘導(dǎo)的肝損傷中GSTA1表達(dá)量減少,JNK被SP600125抑制后肝細(xì)胞中GSTA1表達(dá)量升高,說(shuō)明JNK信號(hào)通路的激活可以減少肝細(xì)胞內(nèi)GSTA1的蛋白表達(dá)。6、Hoechst 33342檢測(cè)凋亡結(jié)果表明,隨著APAP濃度的升高,細(xì)胞發(fā)生凋亡的趨勢(shì)越明顯,細(xì)胞核濃染成明亮藍(lán)色熒光,出現(xiàn)明顯的核固縮;JNK激活被SP600125抑制的肝細(xì)胞中,細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯減少,未見(jiàn)大量核濃染或核碎裂現(xiàn)象。說(shuō)明在APAP誘導(dǎo)的藥物性肝細(xì)胞損傷中,HepG2細(xì)胞凋亡增加,而抑制JNK活化通路能減少由APAP引起的HepG2細(xì)胞的凋亡,表明在APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中JNK信號(hào)通路激活能夠顯著增加肝細(xì)胞的凋亡。本研究成功復(fù)制APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型,并確定JNK抑制劑SP600125的最適作用濃度。在APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中,JNK抑制劑SP600125處理APAP誘導(dǎo)的藥物性肝細(xì)胞損傷模型,肝細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激被減輕。JNK被SP600125抑制時(shí),下游底物c-jun的磷酸化減少,肝細(xì)胞中GSTA1的表達(dá)量提高。確定JNK信號(hào)通路在APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中被激活,JNK信號(hào)通路參與調(diào)控藥物性肝細(xì)胞損傷中GSTA1的表達(dá),但其機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R965;R-332
【圖文】：

分析導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的復(fù)制 HepG2 細(xì)胞藥物性損傷模型復(fù)制的試驗(yàn)中，不同濃度的ALT 和 AST 活性變化如圖 3-1 和圖 3-2。結(jié)果顯示，與對(duì)理后，培養(yǎng)上清中 ALT 和 AST 活性均顯著升高（p<0.05AST 活性均極顯著升高（p<0.01）。在 APAP 濃度分別為 和 AST 活力升高程度不同。因此，選擇 APAP 濃度為 6 m細(xì)胞損傷模型。

ALT 和 AST 活性變化如圖 3-1 和圖 3-2。結(jié)果顯示，與對(duì)理后，培養(yǎng)上清中 ALT 和 AST 活性均顯著升高（p<0.05AST 活性均極顯著升高（p<0.01）。在 APAP 濃度分別為 和 AST 活力升高程度不同。因此，選擇 APAP 濃度為 6 m細(xì)胞損傷模型。比 p<0.05；**表示與對(duì)照組相比 p<0.01 不同濃度 APAP 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清 ALT 活性的影響（ x ±s 3-1 The changes of ALT activity in culture supernatant ( x ±s

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2716204